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有机色谱分离技术

色谱法又称层析法。它是有机化合物分离、分析的重要方法之一。既可用于分离复杂的混合物，又可以用来定性鉴定，尤其适用于少量物质的分离和鉴定。这种技术不仅用于石油、化学化工等部门，而且在药物分析、中草药有效成分的分离分析、药物体内代谢研究、毒物分析及环境保护等方面也是必不可少的工具。

色谱法与溶剂萃取法相似，也是以相分配原理为依据。利用混合物中各组分在某一物质中的吸附、溶解性能的不同或其它亲和作用性能的差异，在混合物的溶液流经该种物质时，通过反复的吸附或分配作用，将各组分分开。流动的混合物溶液称为流动相；固定的物质称为固定相。如果化合物和固定相的作用较弱，那它将在流动相的冲洗下较快地从层析体系中流出来；反之化合物和固定相的作用较强，它将较慢地从层析体系中流出来。根据操作条件的不同，色谱法可分为柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相色谱及高效液相色谱等类型。有机化学实验常用的有薄层色谱、柱色谱和纸色谱。

应用色谱法的目的有两个，一是用于分析，二是用于制备分离。根据实验目的的不同，实际操作中要把握好速度、分离度与分析样品量的关系，如果想得到比较纯的样品，那么上样量就不必太多，样品量少有利于各组分的分离。

    色谱法分离混合物时各组分在固定相表面存在不同的吸附与脱附的平衡，一个分子的吸附性能与极性有关，也与吸附剂的活性及流动相的极性有关。

化合物的极性很大程度依赖于官能团的极性强弱，因此不同类型的化合物往往表现出不同的吸附能力，常见官能团的极性顺序如下：

饱和烃<烯烃<芳烃、卤代烃<硫化物<醚类

硝基化合物<醛、酮、酯<醇、胺<亚胺<酰胺<羧酸

当然这一顺序只是经验值，比较粗略，对于复杂化合物的极性只能通过实验比较。

    在层析中选用何种吸附剂要视被分离的化合物性质而定。理想的吸附剂应该具备以下条件：能够可逆地吸附待层析的物质；不能使被吸附物质发生化学变化；粒度大小应使展开剂以均匀的流速通过。硅胶是实验室应用最广的吸附剂，吸附作用也较强，可用于多种有机物的分离，市场上有各种不同孔径大小的硅胶供应。由于它略带酸性（能与强碱性有机物发生作用），所以适用于极性较大的酸性和中性化合物的分离。纤维素和淀粉的吸附活性最小，因而多用于分离多官能团的天然产物。氧化铝也是一个用途很广的吸附剂，吸附能力强，而且有酸性、碱性和中性三种，酸性氧化铝的pH接近于4，可用于分离氨基酸和羧酸，碱性氧化铝的pH在10左右，用于分离胺类化合物，中性氧化铝pH在7左右，用于分离中性有机物。

影响色谱分离度的另一个重要因素是洗脱剂，洗脱剂的选择主要根据样品的极性、溶解度和吸附剂的活性等因素来考虑。溶剂的极性越大，对特定化合物的洗脱能力也越大。色谱用的展开剂绝大多数是有机溶剂，各种溶剂极性顺序如下：

己烷和石油醚＜环己烷＜四氯化碳＜三氯乙烯＜二硫化碳＜甲苯＜苯＜二氯甲烷 ＜氯仿＜乙醚＜乙酸乙酯＜丙酮＜丙醇＜乙醇＜甲醇＜水＜吡啶＜乙酸

其中四氯化碳、苯、氯仿、甲醇等有一定毒性，应减少使用。这些溶剂可以单独使用，也可以组成混合溶剂使用，特殊情况下还可以先后采用不同极性的溶剂实现梯度淋洗。

1．薄层色谱

薄层色谱（Thin Layer Chromatography）常用TLC表示，是一种微量、快速而简单的色谱法。它兼备了柱色谱和纸色谱的优点。一方面适用于小量样品（几十微克）的分离；另一方面若在制作薄层板时把吸附层加厚，将样品点成一条线，则可分离多达500 mg的样品。因此又可用来精制样品。它是将固定相均匀地涂在薄板（如玻璃板）上，依靠毛细作用力或重力，使流动相通过固定相的一种色谱。该法设备简单、快速简便、选择性强。它不仅适用于有机物的鉴定、纯度的检验、定量分离和反应过程的监控，而且还常用于柱层析的先导，即在大量分离之前，先用薄层色谱进行探索，初步了解混合物的组成情况，寻找适宜的分离条件。在柱层析之后，还可用薄层色谱鉴定洗脱液中的组分。

    薄层色谱的简单操作如下：在洗涤干净的玻璃板上均匀地涂一层吸附剂或支持剂，待干燥、活化后，将样品溶液用管口平整的毛细管点加于薄层板一端，晾干后置薄层板于盛有展开剂的展开槽内，待展开剂前沿接近顶端时，将色谱板取出，干燥后喷以显色剂，或在紫外灯下显色。

    记录原点至样品点中心及展开剂前沿的距离，计算比移值（Rf）：

因为同一物质在相同的实验条件下才具有相同的Rf值，所以在利用薄层色谱分离与鉴定各种化合物时，为了得到重复和较可靠的结果，必须严格控制条件，如吸附剂和展开剂的种类、层析温度等；在测定时，最好用标准物质进行对照。

    薄层色谱最常用的吸附剂是氧化铝和硅胶。硅胶是无定形多孔性物质，略具酸性，适用于酸性物质的分离和分析。薄层色谱用的硅胶分为多种类型，如硅胶H为不含粘合剂的硅胶，硅胶G为含煅石膏粘合剂的硅胶，硅胶HF254—含荧光物质的硅胶，可于波长 254 nm紫外光下观察荧光，硅胶 GF254为既含煅石膏又含荧光剂的的硅胶。氧化铝可根据所含粘合剂或荧光剂而分为氧化铝 G、氧化铝 GF254及氧化铝 HF254等。粘合剂除熟石膏（2CaSO4·H2O）外，还可用淀粉、羧甲基纤维素钠。通常将薄层板按加粘合剂和不加粘合剂分为两种，加粘合剂的薄层板称为硬板，不加粘合剂的称为软板。

薄层色谱还可使用腐蚀性的显色剂，如浓硫酸、浓盐酸和浓磷酸等。在紫外光下观察含有荧光剂的薄层板，展开后的有机化合物在亮的荧光背景上呈暗色斑点。另外也可将几粒碘置于密闭容器中，待容器充满碘的蒸气后将展开后的色谱板放入，碘与展开后的有机化合物可逆地结合，在几秒钟内化合物斑点的位置呈黄棕色。用碘显色时一定要晾干溶剂，因为碘蒸气能与溶剂分子结合，如果不晾干就会掩盖样品点的颜色。 

2．柱色谱

    柱色谱法又称柱上层析法，简称柱层析。它是提纯少量物质的有效方法。常见的有吸附色谱、分配色谱和离子交换色谱。吸附色谱常用氧化铝和硅胶为吸附剂，填装在柱中的吸附剂把混合物中各组分先从溶液中吸附到其表面上，而后用溶剂洗脱。溶剂流经吸附剂时发生无数次吸附和脱附的过程，由于各组分被吸附的程度不同，吸附强的组分移动的慢留在柱的上端，吸附弱的组分移动的快在下端，从而达到分离的目的。分配色谱与液—液连续萃取法相似，它是利用混合物中各组分在两种互不相溶的液相间的分配系数不同而进行分离，常以硅胶、硅藻土和纤维素作为载体，以吸附的液体作为固定相。离子交换色谱是基于溶液中的离子与离子交换树脂表面的离子之间的相互作用，使有机酸、碱或盐类得到分离。

（1）吸附剂的选择

理想的吸附剂应该具备以下条件：能够可逆地吸附待分离的物质；不能使被吸附物质发生化学变化；粒度大小应使展开剂以均匀的流速通过色谱柱。硅胶是实验室应用最广的吸附剂，市场上有各种不同孔径大小的硅胶供应。由于它略带酸性，能与强碱性有机物发生作用，所以适用于极性较大的酸性和中性化合物的分离。

    吸附剂的用量与待分离样品的性质和吸附剂的极性有关。通常吸附剂用量为样品量的30～50倍，如样品中各组分性质相似，则用量应更大。

（2）溶剂和洗脱剂的选择

一般把用以溶解样品的液体称为溶剂，而用来洗色谱柱的液体叫做洗脱剂或淋洗液，两者常为同一物质。在选择时可根据样品中各组分的极性、溶解度和吸附剂的活性等来考虑，且经常要凭经验决定。

洗脱剂的极性大小对混合物的分离影响较大。极性越大，洗脱能力或展开能力越强，化合物移动就越远。因此，所用的洗脱剂应从极性小的开始，以后逐渐增加极性。也可以使用混合溶剂，其极性介于单一溶剂极性之间，并采取逐步增加极性较大溶剂的比例，使吸附强的组分洗脱下来。有时还可以采用梯度淋洗法，即在洗脱过程中，连续改变洗脱剂的组成，使溶剂极性逐渐增加，这样洗脱可使样品中的组分在较短时间内分离完毕。

（3）色谱柱的装填 

色谱柱一般用透明的玻璃做成，便于观察实验情况。底部的玻璃活塞应尽量不涂油脂，以免污染洗脱液。柱子大小视处理量而定，通常柱的直径与高度之比为 1∶10 ～1∶70。

先将色谱柱垂直地固定于支架上，柱的下端铺一层脱脂棉（或玻璃棉）。为了保持平整的表面，可在脱脂棉上再铺一层约5 mm厚的石英砂，有的色谱柱下端已是用砂心片烧结而成，可直接装柱。

    干法装柱：在柱的上端放一玻璃漏斗，使吸附剂经漏斗成一细流，慢慢注入柱中，并经常用橡皮锤或大橡皮塞轻轻敲击管壁，使填装均匀，直到吸附剂的高度约为柱长的四分之三为止。然后沿管壁慢慢地倒入洗脱剂，使吸附剂全部润湿，并略有多余。最后在吸附剂顶部盖一层约5 mm厚的石英砂。由于这种方法在添加溶剂时易出现气泡，吸附剂也可能发生溶胀，所以一般很少采用。为了克服上述缺点，通常先将洗脱剂加入柱内，约为柱高的四分之三处，然后一边通过活塞使洗脱剂缓缓流出，一边将吸附剂通过玻璃漏斗慢慢地加入，同时用橡皮锤轻轻敲击柱身，待完全沉降后，再铺上沙子或用小的圆滤纸覆盖，以防加入样品或洗脱剂冲动吸附剂表面。

湿法装柱：将洗脱剂装入约为柱高的二分之一后，把下端的活塞打开，使洗脱剂一滴一滴地流出，然后通过玻璃漏斗将调好的吸附剂和洗脱剂的糊状物，慢慢地倒入柱内。加完后继续让洗脱剂流出，直到吸附剂完全沉降，高度不变为止，最后再加入石英砂或一张圆滤纸。这种方法比干法好，因为它可把留在吸附剂内的空气全部赶出，使吸附剂均匀地填在柱内。

（4）加样与洗脱

柱填装后，让洗脱剂继续流出，到液面刚好接近吸附剂表面时关闭活塞。将样品溶于少量洗脱剂中，小心地沿柱壁加入柱中，形成均匀的薄层，打开活塞，直到液面接近吸附剂表面时再关闭活塞。用少量洗脱剂洗涤柱壁上的样品，重新打开活塞使液面下降至吸附剂表面。重复3次，使样品全部进入吸附剂，然后用洗脱剂洗脱。洗脱速度不宜过快，以每秒 1～2滴为宜，否则柱中交换来不及达到平衡会影响分离效果。操作过程中要及时添加洗脱剂，不要让洗脱剂走干，否则易产生气泡或裂缝，影响分离效果。

    收集的洗脱液一般5～20 mL为一瓶，具体的量要视情况而定。所得洗脱液可用薄层色谱或纸色谱跟踪，并决定能否合并在一起。对有色物质，也可按色带分别收集。无色的样品如经紫外光照射能呈荧光的，可用紫外光照射来观察和监测混合物展开和洗脱的情况。

洗脱液合并后，蒸去溶剂就可以得到某一组分。如果是几个组分的混合物，需用新的色谱柱或通过其它方法进一步分离。

3．纸色谱

纸色谱法又称纸上层析法，其实验技术与薄层色谱有些相似，但分离的原理更接近于萃取。在纸色谱中，滤纸是载体，不是固定相，滤纸上的水才是固定相（纤维素能吸收高达22％的水），展开剂为流动相。当色谱展开时，溶剂受毛细作用，沿滤纸上升经过点样处，样品中各组分在两相中不断进行分配。由于它们的分配系数不同，结果在流动相中具有较大溶解度的组分移动速度较快，而在水中溶解度较大的组分移动速度较慢，从而达到分离的目的。因此，纸色谱法也称为纸上分配色谱。

与薄层色谱一样，纸色谱也用于有机物的分离、鉴定和定量测定。它特别适用于多官能团或极性大的化合物的分析，例如碳水化合物、氨基酸和天然色素等，只要纸的质量、展开剂和温度等条件相同，比移值（Rf值）对于每种化合物都是一个特定的值，可作为各组分的定性指标。实际上，由于影响比移值的因素很多，实验数据与文献记载的不完全相同，因此在测定时要与标准样品对照才能断定是否为同一物质。纸色谱的缺点是溶剂的展开所需的时间长，操作不如薄层色谱方便。

（1）滤纸的选择 

选择的滤纸应厚薄均匀、平整无折痕，通常用新华1号滤纸。滤纸大小可自行选择，一般长20～30 cm，宽度以样品个数多少而定。操作时手指不能与滤纸的层析部分接触，否则指印将和斑点一起显出。

（2）展开剂的选择 

要根据被分离物质的性质，选用合适的展开剂。水是作为展开剂的一个组分，因此所有展开剂通常需先用水饱和，以使溶剂在滤纸上移动时有足够水分供给滤纸吸附。文献上所指的展开剂如正丁醇－水，就是指用水饱和的正丁醇。

（3）点样 

点样方法与薄层色谱类似。

（4）展开 

展开需在密闭的层析缸中进行，在层析缸中加入展开剂，将滤纸的一端悬挂在层析缸的支架上，另一端浸在展开剂液面下1 cm左右，并使试样的原点在液面之上。由于毛细作用，展开剂沿滤纸条慢慢上升，当接近终点时，取出纸条，记下展开剂前沿位置，晾干。也可将滤纸卷成大圆筒，使点样线在筒的内部进行展开，展开方式除了上述上升法外，还有下降法、双向层析法和环行法等。

（5）显色 

纸色谱的显色与薄层层析相似。