SAINT-BIO/尚宝生物 R23269 Hoechst33258/PI细胞凋亡染色试剂盒

Hoechst33258/PI细胞凋亡染色试剂盒 产品货号：R23269 产品规格：100T 产品简介： Hoechst33258/PI细胞凋亡染色试剂盒(Hoechst 33258/PI Apoptotis Assay Kit)是一种采用Hoechst 33258和碘化 丙啶(Propidiu m Iodide，PI)双荧光染色方法进行细胞周期与细胞坏死分析的检测试剂盒。单纯的PI染色能够观察 DNA直方图上凋亡细胞的亚G1峰，但只能代表G0/G1期发生凋亡，无法观察S期和G2期发生的细胞凋亡，而且细 胞经过固定后无法对活细胞和死细胞进行区分。Hoechst 33258可以穿透细胞膜，进入正常细胞和凋亡细胞与DNA 结合，能在紫外线下显示蓝色荧光，而且染色后凋亡细胞荧光会比正常细胞明显增强。PI不能穿透细胞膜，对于 具有完整细胞膜的正常细胞或凋亡细胞不能染色。而对于坏死细胞，其细胞膜的完整性丧失，PI可以穿透细胞膜 使坏死细胞着色产生红色荧光。 Hoechst 33258/PI双染后，可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来。在二元直方图上， 正 常 细胞 对 Hoechst33258具 有 拒染 性 ， 呈 弱 蓝色 荧 光 ＋ 弱 红色 荧 光 (Hoechst 33258+/PI+)； 凋 亡细 胞 对 Hoechst33258具有嗜染性，呈强蓝色荧光+弱红色荧光(Hoechst 33258+ +/PI+)；坏死细胞对PI具有嗜染性，呈弱蓝 色荧光＋强红色荧光。本试剂盒亦可用荧光显微镜进行观察，检测细胞含量范围一般为0.1～1×10 6之间。 产品组成： 产品名称 100T 保存条件 试剂(A): Cell Stain Buffer(2×) 100ml 4℃ 试剂(B): Hoechst 33258 Stain 0.5ml -20℃，避光 试剂(C): PI Stain 0.5ml -20℃，避光 自备材料： 1. 胰蛋白酶消化液 2. 流式细胞仪或荧光显微镜 3. PBS 4. 细胞计数板 操作步骤(仅供参考)： 1. 细胞样品的制备： ⑴贴壁细胞： ①小心收集细胞培养液到一个无菌离心管内备用。 ②用胰蛋白酶消化细胞至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有 的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。 ③收集上述细胞悬液到离心管内，4℃1000g离心3～5 min，使细胞沉到管底，小心吸取上清并丢弃，可留大约50μl 培养液，以免吸走细胞。 ④加入约1ml提前预冷的PBS，重悬细胞，并转移至1.5ml无菌离心管，4℃1000g离心3～5min，使细胞沉到管底。 ⑤小心吸取上清并丢弃，可留大约50μl PBS，以免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。 ⑵悬浮细胞： ①4℃1000g离心3～5min，使细胞沉到管底，小心吸取上清并丢弃，可留大约50μl培养液，以免吸走细胞。 ②加入约1ml提前预冷的PBS，重悬细胞，并转移至1.5ml无菌离心管，4℃1000g离心3～5min，使细胞沉到管底。 ③小心吸取上清并丢弃，可留大约50μl PBS，以免吸走细胞，轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。 2. 配制Cell Stain Buffer工作液：取适量Cell Stain Buffer(2×)与无菌去离子水或蒸馏水等比例混合，即为Cell Stain Buffer工作液，4℃保存备用。 3. 重悬细胞：取上述收集好的0.1～1×106细胞，加入0.9ml Cell Stain Buffer工作液，重悬细胞沉淀。 4. Hoechst 33258/PI染色： ⑴一步法：加入5μl Hoechst 33258 Stain和5μl PI Stain，轻轻混匀，置于冰浴或4℃，孵育20～30min。 ⑵两步法： ①加入5μl Hoechst 33258 Stain，置于37℃水浴，孵育5～15 min ②置于冰水中冷却后，4℃ 1000g离心3～5 min，使细胞沉到管底，弃上层染色液。 ③加入0.9ml Cell Stain Buffer工作液，重悬细胞沉淀。 ④加入5μl PI Stain，置于冰浴或4℃，孵育20～30min。 5. 检测与分析：用流式细胞仪在激发波长400～500nm检测蓝色荧光，在大于630nm处检测红色荧光，同时检测 光散射情况。采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。如果使用荧光显微镜检测，检测前4℃ 1000g离心3～5min沉淀细胞，用PBS洗涤一次，再涂片观察红色荧光和蓝色荧光。对于贴壁细胞使用荧光显 微镜检测，亦可不收集细胞，弃培养液后直接依次按照上述比例加入试剂(A)、试剂(B)、试剂(C)，冰浴或4℃ 染色20～30min。染色后PBS洗涤一次，再在荧光显微镜下观察。 染色结果：在蓝色荧光对红色荧光的散点图上，正常细胞呈低蓝光 /低红光，凋亡细胞呈高蓝光/低红光，坏死细 胞呈低蓝光/高红光。 注意事项： 1. 荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽快检测。 2. 在为了获得细胞沉淀的离心的过程中，对于特殊细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当提高离心力或延长离 心时间。 3. Heochst 33258与细胞孵育的时间不宜过长，一般控制在20min以内。太长容易引起Heochst 33258的发射光谱 由蓝光向红光迁移，导致红色荧光与兰色荧光的比例改变。 4. 如果用于组织的细胞周期与细胞凋亡检测，则必须把组织消化后，制备成单细胞悬液，才可以进行检测 5. PI对人体有一定刺激性，请注意适当防护。 6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 有效期：12个月有效。4℃保存，5～6个月有效。