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产品基本说明：
| 3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的关键酶，也是生物得以生存的关键酶。广泛存在于动植物和微生物体内，具有影响DNA复制和修补及刺激病毒RNA合成等生物学功能，广泛应用于药物靶标设计。3-磷酸甘油酸激酶催化3-磷酸甘油酸和ATP产生1,3-二磷酸甘油酸和ADP，1,3-二磷酸甘油酸在3-磷酸甘油醛脱氢酶和NADH作用下产生3-磷酸甘油醛、NAD和磷酸，引起340nm处的吸光度下降，即反映了3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。 |
3-磷酸甘油酸激酶（PGK）检测试剂盒（UV板,微量法）
产品货号：BA1004
产品规格：100管/96样
产品简介
3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的关键酶，也是生物得以生存的关键酶。广泛存在于动植物和微生物体内，具有影响DNA复制和修补及刺激病毒RNA合成等生物学功能，广泛应用于药物靶标设计。3-磷酸甘油酸激酶催化3-磷酸甘油酸和ATP产生1,3-二磷酸甘油酸和ADP，1,3-二磷酸甘油酸在3-磷酸甘油醛脱氢酶和NADH作用下产生3-磷酸甘油醛、NAD和磷酸，引起340nm处的吸光度下降，即反映了3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
产品内容：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体120mL×1瓶 | 4℃ |
试剂一 | 液体10mL×1瓶 | 4℃ |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | -20℃ |
试剂三 | 粉剂×1支 | -20℃ |
试剂四 | 粉剂×1支 | -20℃ |
试剂五 | 粉剂×1瓶 | -20℃ |
溶液的配制：
1. 试剂二：临用前加入2.5mL蒸馏水充分溶解后待用，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
2. 试剂三：临用前加入1mL蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
3. 试剂四：临用前加入1mL蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
4. 试剂五：粉剂置于试剂瓶内棕色管中。临用前加入4mL蒸馏水充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
5. 工作液的配制：按照蒸馏水：试剂一：试剂二：试剂三：试剂四：试剂五=6:10:2:1:1:4的体积比例充分混匀，现用现配。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、低温台式离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤（仅供参考）：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 血清/血浆：直接检测。
二、测定步骤
1. 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2. 样本测定：(在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入下列试剂)
试剂名称（µL） | 空白管 | 测定管 |
工作液 | 180 | 180 |
样本 | - | 20 |
蒸馏水 | 20 | - |
在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入上述试剂，充分混匀后于340nm处测定10s时的吸光值A1，迅速置于37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）水浴或培养箱5min（酶标仪有控温功能可将温 度调至37℃或25℃），拿出迅速擦干测定310s时的吸光值A2，计算ΔA测定管=A1测定-A2测定，ΔA空白管=A1空白-A2空白，ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管。（空白管只需做1-2次）。 | ||
三、PCK活性计算
A、按微量石英比色皿计算：
1. 按照样本蛋白浓度计算
酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PGK（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10 9÷(V样×Cpr) ÷T
=321.54×ΔA÷Cpr
2. 按照样本质量计算
酶活单位定义：每克组织每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PGK（U/g质量）=ΔA÷（ε×d）×V反总×109÷(W×V样÷V样总) ÷T
=321.54×ΔA÷W
3. 按照液体体积计算
酶活单位定义：每mL血清（浆）每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PGK（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V反总×109÷V样÷T
=321.54×ΔA÷W
4. 按照细胞数量计算
酶活单位定义：每104个细胞每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PGK（U/104 cell）=ΔA÷（ε×d）×V反总×109÷(500×V样÷V样总)÷T
=0.643×ΔA
V反总：反应体系总体积，2×10-4L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g；500：500万个细胞；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
B、按96孔UV板计算：
将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm（96孔UV板光径）进行计算即可。
注意事项：
1. ΔA大于0.8或者A1测定小于0.9时（96孔UV板是当ΔA大于0.5或者A1测定小于0.6时），建议将粗酶液用提取液稀释后再进行测定。当ΔA小于0.01时，可以延长反应时间（10min或15min）或增加样本体积来测定。
2. 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过0.01。
3. 样本的蛋白浓度需自行测定，由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约1mg/mL），所以测定样本蛋白浓度时需扣除提取液自身蛋白浓度。
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