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产品基本说明:
4-香豆酸:辅酶A连接酶(4-coumarate:CoA ligase,4CL)是木质素生物合成的关键酶之一,主要催化肉桂酸及其羟基或者甲氧基衍生物生成相应的辅酶A酯,这些中间产物随后进入苯丙类衍生物支路合成途径。该酶主要存在于高等植物、酵母和菌类中,研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理,为减少水果石细胞含量而提高其品质提供依据。 4CL催化4-香豆酸和CoA生成4-香豆酸CoA,其在333nm下测有特征吸收峰,测定4-香豆酸CoA的生成速率,即可反应4CL活性。 |
4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)活性检测试剂盒(微量法)
产品货号:BA1006
产品规格:100管/96样
产品简介
4-香豆酸:辅酶A连接酶(4-coumarate:CoA ligase,4CL)是木质素生物合成的关键酶之一,主要催化肉桂酸及其羟基或者甲氧基衍生物生成相应的辅酶A酯,这些中间产物随后进入苯丙类衍生物支路合成途径。该酶主要存在于高等植物、酵母和菌类中,研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理,为减少水果石细胞含量而提高其品质提供依据。
4CL催化4-香豆酸和CoA生成4-香豆酸CoA,其在333nm下测有特征吸收峰,测定4-香豆酸CoA的生成速率,即可反应4CL活性。
产品内容:
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体60mL×2瓶 | 4℃ |
试剂一 | 液体15mL×1瓶 | 4℃ |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | -20℃ |
试剂三 | 液体3mL×1瓶 | 4℃ |
试剂四 | 粉剂×1瓶 | -20℃ |
试剂五 | 粉剂×1支 | 4℃ |
溶液的配制:
1. 提取液:内含不溶物,使用前摇匀;
2. 试剂二:临用前加入3mL蒸馏水溶解,可以分装后-20℃保存,避免反复冻融;
3. 试剂四:临用前用4mL蒸馏水溶解备用,可以分装后-20℃保存,避免反复冻融;
4. 试剂五:加入1mL蒸馏水溶解,临用前用蒸馏水稀释40倍后备用,现用现配;
5. 工作液的配制:按体积比将试剂二:试剂三:试剂四:试剂五=1:1:1:1的比例配制工作液,现用现配。
注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤(仅供参考):
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1. 细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2. 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
二、测定步骤
1. 紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至333nm,蒸馏水调零。
2. 操作表(在0.5mL EP管中进行下列操作):
试剂名称(µL) | 测定管 | 空白管 |
样本 | 20 | - |
蒸馏水 | - | 20 |
工作液 | 80 | 80 |
试剂一 | 100 | 100 |
充分混匀后测定333nm下的初始值A1,37℃反应30min后再次测定吸光值A2,计算ΔA 测定管=A2测定管-A1测定管,ΔA空白管= A2空白管-A1空白管,ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管。 |
三、4CL活计算
A、按微量石英比色皿计算:
1. 按样本蛋白浓度计算:
单位定义:每mg组织蛋白每分钟生成1nmol 4-香豆酸辅酶A定义为一个酶活力单位。
4CL(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109 ]÷(V样×Cpr) ÷T
=15.87×ΔA÷Cpr
2. 按样本质量计算:
单位定义:每g组织每分钟生成1nmol 4-香豆酸辅酶A定义为一个酶活力单位。
4CL(U/g质量)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109 ]÷(W×V样÷V样总) ÷T
=15.87×ΔA÷W
3. 按细菌或细胞数量计算:
单位定义:每1万个细菌或细胞每分钟生成1nmol 4-香豆酸辅酶A定义为一个酶活力单位。
4CL(U/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109 ]÷(500×V样÷V样总) ÷T
=0.03174×ΔA
V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:4-香豆酸辅酶A摩尔消光系数,2.1×104 L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.02mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,30min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万;109:单位换算系数,1mol=109nmol。
B、按96孔UV板计算:
将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm(96孔UV板光径)进行计算即可。
注意事项:
1. 若ΔA大于0.5,将样本用蒸馏水稀释后再进行测定。
2. 建议一次测定不要测定过多样本以免耽误过多的酶促反应时间。
3. 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔,正常情况下,变化不超过0.01。
产品介绍: