SAINT-BIO/尚宝生物 BA1969 5'-核苷酸酶活性检测试剂盒（微量法）

5’-核苷酸酶活性检测试剂盒（微量法） 产品货号: BA1696 产品规格: 100T/48S 产品简介： 5'-核苷酸酶(5'-NT)是一种对底物特异性不高的水解酶，可作用于多种核苷酸。广泛存在于各种植物、动物组 织、 血清血浆中。5'-NT是一种特殊的磷酸酯水解酶，它只作用于核苷-5'-磷酸如AMP(腺苷-5'-磷酸或腺苷酸)生成 无机 磷酸和核苷。通过定磷显色法测定所生成的无机磷含量，可以计算出5'-NT的活性高低。 注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增 加样本量进行检测。 产品组成： 产品名称 规格 保存条件 提取液 液体30ml×1瓶 -20℃ 试剂一 粉剂×2支 -20℃ 试剂二 液体5ml×2瓶 2-8℃ 试剂三 液体12ml×1瓶 2-8℃ 试剂四 液体15ml×1瓶 2-8℃ 试剂五 粉剂×1瓶 2-8℃ 试剂六 粉剂×1瓶 2-8℃ 试剂七 液体4ml×1瓶 室温 标准品 粉剂×1瓶 2-8℃ 溶液的配制： 1. 试剂五：临用前加入4mL蒸馏水，充分溶解，用不完的试剂4℃保存两周。 2. 试剂六：临用前加入4mL蒸馏水，充分溶解，用不完的试剂4℃保存两周。 3. 工作液配制：临用前取1支试剂一中加入到1瓶试剂二中充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存一周，现用现 配。 4. 定磷试剂的配制：按H2O：试剂五：试剂六：试剂七=2:1:1:1的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色。若无 色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少）。 5. 标准品：8mg磷标准品。临用前加入4.6mL试剂四溶解配制成10μmol/mL的标准溶液，溶解后4℃保存两周。 需自备的仪器和用品： 天平、可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、低温离心机、恒温水浴锅/恒温培养箱、微量玻璃比色皿/96孔 板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。 操作步骤（仅供参考）： 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） 1. 组织：按照质量（g）﹕提取液体积(mL)为1﹕5-10的比例（建议称取约0.05g，加入0.5mL提取液），冰上匀 浆后于4℃，15000g离心10min，取上清置于冰上待测。 2. 细胞：按照细胞数量（10 4个）﹕蒸馏水体积（mL）为500-1000﹕1的比例（建议500万个细胞加入0.5mL蒸馏 水）， 冰浴超声波破碎细胞（功率300W，超声3s，间隔7s，总时间3min）；然后4℃，15000g离心10 min， 取上清置于冰上待测。 3. 血清：直接检测。 二、测定步骤 1. 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至660nm，蒸馏水调零。 2. 将标准品用试剂四稀释至0.96、0.48、0.24、0.12、0.06、0.03、0.015μmol/mL标准液。 3. 标准品稀释表 序号 稀释前浓度（µmol/mL） 标准液体积（µL） 试剂四体积（µL） 稀释后浓度（µmol/mL） 1 10 48 452 0.96 2 0.96 200 200 0.48 3 0.48 200 200 0.24 4 0.24 200 200 0.12 5 0.12 200 200 0.06 6 0.06 200 200 0.03 7 0.03 200 200 0.015 实验中每个标准管需80µL标准溶液。 4. 操作表（在1.5mL EP管中操作） （1）酶促反应 试剂名称（μl） 测定管 对照管 样本 20 20 工作液 80 - 漩涡混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（植物及其他）反应30 min 试剂三 100 100 工作液 - 80 漩涡混匀，25℃，8000rpm离心10min，取上清进行显色反应 （2）显色反应 试剂名称（μl） 测定管 对照管 标准管 空白管 上清液 80 80 - - 标准管 - - 80 - 试剂四 - - - 80 定磷试剂 160 160 160 160 漩涡混匀，40℃显色10min；取200μL反于微量玻璃比色皿/96孔板中，在660nm下测 定吸光值A，分别记为A测定、A对照、A标准、A空白。 计算ΔA标准=A标准-A空白，ΔA测定=A测定-A对照（空白管只需测定1-2次）。 三、5'-NT活性计算 1. 标准曲线的绘制： 以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y= kx+b，将ΔA带入方 程得到x（μmol/mL）。 2. 5'-NT活性的计算 （1）按样本蛋白浓度计算 酶活单位定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位。 5'-NT酶活（U/mg prot）=x×V反总÷(V样×Cpr)÷T×10 3=333.3×x÷Cpr （2）按样本质量计算 酶活单位定义：每克组织在反应体系中每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活单位。 5'-NT酶活（U/g质量）=x×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T×10 3=166.67×x÷W （3）按细胞数计算： 酶活单位定义：每10 4个细胞在反应体系中每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位。 5'-NT酶活（U/10 4 cell）=x×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T×10 3=166.67×x÷细胞数量 （4）按液体体积计算： 酶活单位定义：每毫升液体在反应体系中每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位。 5'-NT酶活（U/mL）=x×V反总÷V样÷T×103=333.3×x V样：酶促反应中加入样本体积，0.02mL；V反总：酶促反应总体积，0.2mL；V样总：加入提取液的体积， 0.5mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；细胞数量：以万计；T：酶促反应时间，30 min；10 3： 单位换算，1μmol=10 3nmol。 注意事项: 1. ΔA测定大于1或者A测定管大于1时，建议将样本用试剂四稀释后再进行测定。 实验实例： 1. 取0.05g小鼠肝，进行样本处理，取上清后按照测定步骤操作，使用96孔板测得计算ΔA测定管=A测定-A对照 =0.449-0.334=0.115，带入标准曲线y=1.5514x+0.0038，计算x=0.0717，按照样本质量计算酶活得： 5'-NT酶活（U/g质量）=333.3×x÷W=333.3×0.0717÷0.1=238.98 U/g 质量。 2. 取0.05g稗草，进行样本处理，取上清后按照测定步骤操作，使用96孔板测得计算ΔA测定管=A测定-A对照 =0.245-0.196=0.049，带入标准曲线y=1.5514x+0.0038，计算x=0.0291，按照样本质量计算酶活得： 5'-NT酶活（U/g质量）=333.3×x÷W=333.3×0.0291÷0.1=97.00 U/g质量。