SAINT-BIO/尚宝生物 BA1549 5＇-核苷酸酶（5＇-NT）检测试剂盒（钼蓝微板法）

5＇-核苷酸酶（5＇-NT）检测试剂盒（钼蓝微板法） 产品货号：BA149 产品规格：100T 产品简介： 5´-核苷酸酶(5´-NT或NTP)广泛分布于肝脏、胆道及其他各种组织中，该酶活性变化常与ALP活性相平行。但在骨骼 系统的疾病中，如肿瘤骨转移、畸形性骨炎、甲亢、佝偻病等，ALP活力增高，但是5´-NT活力正常。所以对于ALP活力 提高的情况，测定5´-NT活力有助于判断 ALP 活力增高原因是肝胆系统疾病还是骨骼系统疾病。 5´-核苷酸酶(5´-NT)检测试剂盒(钼蓝微板法)的检测原理为5´-核苷酸酶能催化5´-磷酸腺苷(AMP)水解，生成腺苷和 磷酸，后者与钼酸铵反应生成钼蓝，可用比色法测定无机磷的含量，计算5´-NT活性。利用镍离子能选择性的抑制5´-NT 的特性，在测定管不加人抑制剂镍离子，测出的活性为ALP和5´-NT总活性，在对照管加入镍离子，可以测出ALP的活性。 测定管的酶活性减去对照管的酶活性即获得5´-NT活性。通过酶标仪检测680nm处吸光度。5´-核苷酸酶的检测对于研究自 由基代谢平衡，抗衰老和肿瘤发病机制具有一定的价值。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 产品组成： 产品组成 100T 保存条件 试剂(A): NT Assay bufferⅠ 15ml 室温 试剂(B): NT Assay buffer Ⅱ 2ml 室温 试剂(C): NT Assay buffer Ⅲ 1ml 室温 试剂(D): 5´-A MP buffer 2ml 4℃ 试剂(E): AMP酸性缓冲液 50ml 4℃，避光 试剂(F): 磷标准(6mmol/L) 1ml 4℃ 试剂(G): 定磷酸性液 18ml 室温 试剂(H): 定磷还原液 3ml 4℃，避光 试剂(I): 钼酸铵溶液 3ml 4℃ 需自备的仪器和用品： 1. 蒸馏水、生理盐水 2. 离心管或EP管 3. 离心机、水浴锅 4. 96孔板、酶标仪 操作步骤（仅供参考）： 1. 准备样品： ①血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备，可以直接用于本试剂盒的测定，尿液通常也可以直接用于测 定，-20℃冻存，用于5´-NT的检测。 ②细胞或组织样品：取恰当细胞或组织进行裂解，可以采用RAPI裂解液，如果有必要需进行适当匀浆，低速离心取上清， -20℃冻存，用于5´-NT的检测。 ③高活性样品：如果样品中含有较高活性的5´-NT，可以使用AMP酸性缓冲液稀释。 ④(选做)样品准备完毕后可以用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，以便于后续计算单位蛋白重量组织或细胞内的5 ´-NT含量。 2. 配制对照NT Assay工作液：取适量的NT Assay bufferⅠ、Ⅱ、Ⅲ，按Ⅰ：Ⅱ：Ⅲ=13：1：2的比例混合，即为对照NT Assay 工作液，4℃保存备用。 3. 配制测定NT Assay工作液：取适量的NT Assay bufferⅠ、Ⅱ，按Ⅰ：Ⅱ=15：1的比例混合，即为测定NT Assay工作 液，4℃保存备用。 4. 配制磷标准工作液：取适量的磷标准(6mmol/L)，按磷标准(6mmol/L)：AM P酸性缓冲液=1：99的比例混合，即为磷 标准工作液(0.06mmol/L)，4℃保存1个月。 5. 配制定磷工作液： 按 定磷酸性液：定磷还原液：钼酸铵溶液=6：1：1混匀，即为定磷工作液工作液，4℃保存。 6. NT酶促反应：按照下表设置对照管、测定管，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡。如果样品中的酶活 性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定。 加入物(ml) 对照管 测定管 待测样品 0.01 0.01 对照NT Assay工作液 0.08 - 测定NT Assay工作液 - 0.08 混匀，置于37℃水浴保温5min。 5´-A MP buffer 0.01 0.01 混匀，置于37℃水浴保温30min。 AMP酸性缓冲液 0.1 0.1 上表中各管充分混匀，3000g离心10min，取0.1ml上清液按下表进行显色反应。 7. NT显色反应：按照下表设置空白管、标准管、对照管、测定管溶液应按照顺序依次加入96孔板，并注意避免产生气 泡。如果样品中的酶活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定。 加入物(ml) 空白管 标准管 对照管 测定管 蒸馏水 0.05 0.05 - - 标准工作液 - 0.05 - - 对照管上清液 - - 0.1 - 测定管上清液 - - - 0.1 AMP酸性缓冲液 0.05 - - - 定磷工作液 0.2 0.2 0.2 0.2 8. NT测定：混匀，静置5min，蒸馏水调零，酶标仪测定680nm处吸光度(分别记为A空白、A标准、A对照、A测定)。 计算： 5´-NT活性单位的定义：在37℃条件下1L血清与底物作用，1min催化产生1μmol磷酸(以磷计)为1个5´-NT酶活力单位， 根据酶活性定义计算出样品中的5´-NT活性。 血清、血浆、尿液中5´-NT活力计算公式： 血清5´-NT活力(U/L)=｛(A测定－A对照)/(A标准－A空白)｝×0.06×1000×N/(30×0.005) =(A测定－A对照)/(A标准－A空白)×400×N 组织、细胞中5´-NT活力计算公式： 组织、细胞5´-NT活力(U/mg)=｛(A测定－A对照)/(A标准－A空白)｝×0.06×N/(30×0.005×10 -3×待测样品蛋白浓度) =(A测定－A对照)/(A标准－A空白)×400×N/待测样品蛋白浓度 式中：A测定=测定管的吸光度 A对照=对照管的吸光度 A标准=标准管的吸光度 A空白=空白管的吸光度 0.06=磷标准工作液(0.06mmol/L) 30=酶促反应时间(min) 0.005=实际参加反应的样品体积(ml) N=待测样品检测前的稀释倍数 待测样品蛋白浓度 单位 g/L