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产品基本说明:
α-GAL (EC 3.2.1.22)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,能专一地催化α半乳糖苷键的水解,主要参与棉子糖、水苏糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-GAL对于植物种子的萌发至关重要,种子萌发初期,其催化产生的D-半乳糖通过糖酵解途径迅速转化和消耗,为种子的萌发提供Γ初的能量来源,后期则主要参与细胞壁储藏多糖水解。 α-GAL分解对-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚,后者在400nm有Γ大吸收峰,通过测定吸光值升高速率来计算α-GAL活性。 |
α-半乳糖苷酶(α-GAL)活性检测试剂盒(微量法)
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
产品货号:BA1014
产品规格:100管/48样
产品内容:
提取液:液体100mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:粉剂×1瓶,-20℃保存;临用前每瓶加入2.5mL双蒸水,充分溶解备用;用不完的试剂仍-20℃保存。
试剂二:液体4mL×1瓶,4℃保存。
试剂三:液体15mL×1瓶,4℃保存。
标准液:液体1mL×1支,4℃保存,5μmol/mL对硝基苯酚溶液。
产品说明:
α-GAL (EC 3.2.1.22)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,能专一地催化α半乳糖苷键的水解,主要参与棉子糖、水苏糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-GAL对于植物种子的萌发至关重要,种子萌发初期,其催化产生的D-半乳糖通过糖酵解途径迅速转化和消耗,为种子的萌发提供Γ初的能量来源,后期则主要参与细胞壁储藏多糖水解。
α-GAL分解对-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚,后者在400nm有Γ大吸收峰,通过测定吸光值升高速率来计算α-GAL活性。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、粗酶液提取:
1、细菌或培养细胞的处理:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率20%,超声3s,间隔10s,重复30次),15000g,4℃,离心20分钟,取上清,置冰上待测。
2、组织的处理:称取约0.1g组织,加入1mL提取液进行冰浴匀浆;15000g,4℃,离心20min,取上清,置冰上待测。
3、标准液的处理:用蒸馏水将标准液稀释至200、100、50、25、12.5、6.25、0nmol/mL。
二、测定步骤:
1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至400nm,蒸馏水调零。
2、 样本测定,(在EP管或96孔板中依次加入下列试剂):
试剂名称(µL) | 测定管 | 对照管 | 标准管 |
试剂一 | 25 | ||
蒸馏水 | 25 | ||
试剂二 | 35 | 35 | |
样本 | 10 | 10 | |
迅速混匀,放入37℃准确水浴30min | |||
标准液 | 70 | ||
试剂三 | 130 | 130 | 130 |
充分混匀, 400nm处测定吸光值A。△A=A测定管-A对照管
α-GAL活性计算:
根据标准管的吸光度(x:各标准管吸光值减去浓度为零的标准管的吸光值)和浓度(y,nmol/mL)
建立标准曲线,将△A带入标准曲线中,计算样品生成的产物量(nmol/mL)。
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
α-GAL 活力(nmol/h /mg prot)=(y×V反总)÷(V样×Cpr)÷T=14×y÷Cpr
需要另外测定,建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
α-GAL 活力(nmol/h /g鲜重)=(y×V反总)÷(W×V样÷V样总)÷T=14×y ÷W
(3)按细菌或细胞数量计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
α-GAL 活力(nmol/h /104 cell)= (y×V反总)÷(500×V样÷V样总)÷T=0.028×y
Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;V反总:反应体系总体积,0.07mL;V样:加入反应体系中样本体积,0.01mL;V样总:加入提取液体积,1mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万;T:反应时间,0.5h。
产品介绍: