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产品基本说明:
AGP (EC 2.7.7.21)主要存在于植物中,催化葡萄糖-1-磷酸与ATP反应生成淀粉合成的直接前体ADPG,是植物淀粉生物合成的主要限速步骤。 AGP催化的逆向反应生成G-1-P,在反应体系中添加的磷酸己糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成6- 磷酸葡萄糖酸和NADPH,340nm下测定NADPH增加速率,即可计算AGP活性。 |
ADPG焦磷酸化酶(AGP)活性检测试剂盒(微量法)
产品货号:BA1036
产品规格:100管/96样
产品说明:
AGP (EC 2.7.7.21)主要存在于植物中,催化葡萄糖-1-磷酸与ATP反应生成淀粉合成的直接前体ADPG,是植物淀粉生物合成的主要限速步骤。
AGP催化的逆向反应生成G-1-P,在反应体系中添加的磷酸己糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成6- 磷酸葡萄糖酸和NADPH,340nm下测定NADPH增加速率,即可计算AGP活性。
注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
产品内容:
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体100mL×1瓶 | 4℃ |
试剂一 | 液体20mL×1瓶 | 4℃ |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | -20℃ |
试剂三 | 粉剂×2瓶 | 4℃ |
试剂四 | 粉剂×2支 | -20℃ |
试剂五 | 液体250μL×2支 | -20℃ |
溶液的配制:
1. 试剂二:临用前每支加入6.4mL双蒸水充分溶解备用;用不完的试剂-20℃分装保存;
2. 试剂三:临用前加入2mL双蒸水充分溶解备用;用不完的试剂-20℃分装保存;
3. 试剂四:临用前每支加入500μL双蒸水充分溶解备用;用不完的试剂-20℃分装保存;
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
称取约0.1g组织加入1mL提取液,冰浴中匀浆。10000g,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
二、测定步驟
1. 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2. 在EP管中按顺序加入下列试剂
试剂(μL) | 测定管 |
试剂一 | 40 |
试剂二 | 64 |
样本 | 8 |
混匀,30℃保温15min,置沸水浴中1min(盖紧,防止水分散失),冰浴迅 速冷却。试剂一、试剂三置37℃保温10min以上。 | |
试剂一 | 120 |
试剂三 | 40 |
试剂四 | 8 |
试剂五 | 4 |
混匀后立即在340nm波长下记录初始吸光度A1和2min后的吸光度A2,计算ΔA=A2-A1。
二、AGP活性计算
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:
1. 按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活性单位。
AGP活性(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V反总÷T÷(Cpr×V样本)=380.5×ΔA÷Cpr
(此法需要自行测定粗酶液蛋白质浓度)
2. 按照样本质量计算
单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
AGP活性(U/g 质量)=ΔA÷(ε×d)×V反总÷T÷(W×V样本÷V提取)=380.5×ΔA÷W
T:反应时间,15min;ε:NADPH消光系数,6.22×10-3mL/nmol/cm;V反总:反应总体积,0.284mL;d:石英比色皿光程,1cm;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;V样本:加入的样本体积,0.008mL;V提取:加入的提取液体积,1mL;W:样本质量,g。
b.使用96孔UV板测定的计算公式如下:
1. 按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活性单位。
AGP活性(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V反总÷T÷(Cpr×V样本)=634.1×ΔA÷Cpr
(此法需要自行测定粗酶液蛋白质浓度)
2. 按照样本质量计算
单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
AGP活性(U/g 质量)=ΔA÷(ε×d)×V反总÷T÷(W×V样本÷V提取)=634.1×ΔA÷W
T:反应时间,15min;ε:NADPH消光系数,6.22×10 -3mL/nmol/cm;V反总:反应总体积,0.284mL;d:96 孔板光程,0.6cm;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;V样本:加入的样本体积,0.008mL;V提取:加入的提取液体 积,1mL;W:样本质量,g。
注意事项:
如果一次性测定样本较多,可以将试剂一、二按比例配成混合液1,将试剂一、三、四和五按比例配成混合液2。
产品介绍: