SAINT-BIO/尚宝生物 BA1920 ATP-柠檬酸裂解酶（ACL）活性检测试剂盒（紫外分光光度法）

ATP-柠檬酸裂解酶（ACL）活性检测试剂盒（紫外分光光度法）产品货号：BA1920

产品规格：50T/48S

产品简介：

ATP-柠檬酸裂解酶（ATP-citrate lyase，ACL）是催化柠檬酸生成乙酰辅酶A的关键胞质酶，其催化产生的乙酰辅酶A是合成脂肪酸与胆固醇等脂类物质的主要原料，并可参与相关重要蛋白的修饰作用，是体内能源物质代谢的枢纽性物质。

在ATP和辅酶A存在的情况下，ACL能将柠檬酸催化裂解为乙酰辅酶A、草酰乙酸、ADP和磷酸盐，苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH生成苹果酸和NAD+，导致340nm处光吸收下降。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品组成：

溶液的配制：

1. 试剂二：临用前加入1mL试剂一，充分溶解待用；可分装后-20℃保存，避免反复冻融；

2. 试剂三：临用前加入5mL试剂一，充分溶解待用；可分装后-20℃保存，避免反复冻融；

3. 试剂四：临用前加入1mL试剂一，充分溶解待用；可分装后-20℃保存，避免反复冻融；

4. 试剂五：临用前加入1mL试剂一，充分溶解待用；可分装后-20℃保存，避免反复冻融；

5. 提取液的配制：按提取液一：提取液二=990：10（V︰V）的比例配制，根据样本量现配现用，禁止将提取液二一次性全部加入提取液一混匀分装待用。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、天平、台式低温离心机、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、水浴锅、冰盒。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：按照质量（g）︰提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆。于 4℃，8000g离心10min，取上清，置于冰上待测。

2. 细胞或细菌：按照细胞或细菌数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞或细菌加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞或细菌（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min），于4℃，8000g离心10min，取上清，置于冰上待测。

3. 血清（浆）或其他液体：直接检测。

二、测定步骤

1. 分光光度计预热30min以上，波长调至340nm，蒸馏水调零。

2. 将试剂一置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min。

3. 操作表 (在1mL石英比色皿中依次加入下列试剂) ：

注意：如果样本量大，可按试剂一：试剂二：试剂三：试剂四：试剂五=161：4：20：4：1的比例配制成工作液使用，工作液应根据样本量现配现用。

三、ACL活性计算

1. 按样本蛋白浓度计算

单位定义：每mg蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位

ACL活性（U/mg prot）=[ΔA×V反总×10⁹÷（ε×d）]÷(V样×Cpr) ÷T=1607.7×ΔA÷Cpr

2. 按样本质量计算

单位定义：每g组织每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

ACL活性（U/g 质量）=[ΔA×V反总×10⁹÷（ε×d）]÷(W ×V样÷V样总)÷T=1607.7×ΔA÷W

3. 按照细胞数量计算

单位定义：每1万个细胞或细菌每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

ACL活性（U/10⁴ cell）=[ΔA×V反总×10⁹÷（ε×d）] ÷(500×V样÷V样总) ÷T=3.215×ΔA

4. 按液体体积计算

单位定义：每mL液体每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

ACL（U/mL）=[ΔA×V反总×10⁹÷（ε×d）]÷V样÷T=1607.7×ΔA

V反总：反应总体积，1×10^-3L；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g；500：细胞或细菌数量，500万；T：反应时间，2min