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产品基本说明:
ATP-柠檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase,ACL)是催化柠檬酸生成乙酰辅酶A的关键胞质酶,其催化产生的乙酰辅酶A是合成脂肪酸与胆固醇等脂类物质的主要原料,并可参与相关重要蛋白的修饰作用,是体内能源物质代谢的枢纽性物质。 在ATP和辅酶A存在的情况下,ACL能将柠檬酸催化裂解为乙酰辅酶A、草酰乙酸、ADP和磷酸盐,苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH生成苹果酸和NAD+,导致340nm处光吸收下降。 |
ATP-柠檬酸裂解酶(ACL)活性检测试剂盒(微量法)
产品货号:BA1921
产品规格:100T/96S
产品简介:
ATP-柠檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase,ACL)是催化柠檬酸生成乙酰辅酶A的关键胞质酶,其催化产生的乙酰辅酶A是合成脂肪酸与胆固醇等脂类物质的主要原料,并可参与相关重要蛋白的修饰作用,是体内能源物质代谢的枢纽性物质。
在ATP和辅酶A存在的情况下,ACL能将柠檬酸催化裂解为乙酰辅酶A、草酰乙酸、ADP和磷酸盐,苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH生成苹果酸和NAD+,导致340nm处光吸收下降。
注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
产品组成:
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液一 | 液体100mL×1瓶 | 2-8℃ |
提取液二 | 液体1mL×1支 | -20℃ |
试剂一 | 液体30mL×1瓶 | 2-8℃ |
试剂二 | 粉剂×1支 | -20℃ |
试剂三 | 粉剂×1瓶 | -20℃ |
试剂四 | 粉剂×1支 | -20℃ |
试剂五 | 液体15μL×1支 | 2-8℃ |
溶液的配制:
1. 试剂二:临用前加入500μL试剂一,充分溶解待用;可分装后-20℃保存,避免反复冻融;
2. 试剂三:临用前加入2mL试剂一,充分溶解待用;可分装后-20℃保存,避免反复冻融;
3. 试剂四:临用前加入0.5mL试剂一,充分溶解待用;可分装后-20℃保存,避免反复冻融;
4. 试剂五:临用前加入0.5mL试剂一,充分溶解待用;可分装后-20℃保存,避免反复冻融;
5. 提取液的配制:按提取液一:提取液二=990:10(V︰V)的比例配制,根据样本量现配现用,禁止将提取液二一次性全部加入提取液一混匀分装待用。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计/酶标仪、天平、台式低温离心机、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、水浴锅、冰盒。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1. 组织:按照质量(g)︰提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g,加入1mL提取液)进行冰浴匀浆。于4℃,8000g离心10min,取上清,置于冰上待测。
2. 细胞或细菌:按照细胞或细菌数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞或细菌加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞或细菌(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min),于4℃,8000g离心10min,取上清,置于冰上待测。
3. 血清(浆)或其他液体:直接检测。
二、测定步骤
1. 分光光度计/酶标仪预热30min以上,波长调至340nm,蒸馏水调零。
2. 将试剂一置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴10min。
3. 操作表 (在微量石英比色皿/96孔UV板中依次加入下列试剂) :
试剂名称(μL) | 测定管 | 空白管 |
试剂一 | 161 | 161 |
试剂二 | 4 | 4 |
试剂三 | 20 | 20 |
试剂四 | 4 | 4 |
试剂五 | 1 | 1 |
样本 | 10 | - |
蒸馏水 | - | 10 |
在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入上述试剂,充分混匀后于340nm处测定10s时的吸光值A1,迅速置于37℃水浴/ 25℃(其它物种)或培养箱2min(酶标仪有控温功能可将温度调至37℃),拿出迅速 擦干测定130s时的吸光值A2,计算ΔA测定管= A1测定-A2测定,ΔA空白管=A1空白-A2空白,ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管(空白管只需做1-2次)。 |
注意:如果样本量大,可按试剂一:试剂二:试剂三:试剂四:试剂五=161:4:20:4:1的比例配制成工作液使用,工作液应根据样本量现配现用。
二、ACL活性计算
A、按微量石英比色皿计算:
1. 按样本蛋白浓度计算
单位定义:每mg蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位
ACL活性(U/mg prot)=[ΔA×V反总×109÷(ε×d)]÷(V样×Cpr) ÷T=1607.7×ΔA÷Cpr
2. 按样本质量计算
单位定义:每g组织每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
ACL活性(U/g 质量)=[ΔA×V反总×109÷(ε×d)]÷(W ×V样÷V样总)÷T=1607.7×ΔA÷W
3. 按照细胞数量计算
单位定义:每1万个细胞或细菌每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
ACL活性(U/104 cell)=[ΔA×V反总×109÷(ε×d)] ÷(500×V样÷V样总) ÷T=3.215×ΔA
4. 按液体体积计算
单位定义:每mL液体每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
ACL(U/mL)=[ΔA×V反总×109÷(ε×d)]÷V样÷T=1607.7×ΔA
V反总:反应总体积,2×10-4L;109:单位换算系数,1mol=109nmol;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.01mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:蛋白浓度,mg/mL,蛋白浓度自行测定;W:样本质量,g;500:细胞或细菌数量,500万;T:反应时间,2min
B、按照96孔UV板计算
将将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm(96孔板光径)进行计算即可。
产品介绍: