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产品基本说明：
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ATP广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是生物能量通货，能荷是描述细胞能量代谢状态的主要 参数。测定ATP含量并且计算能荷，能够反映能量代谢状态。 HK催化葡萄糖和ATP合成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化6-磷酸葡萄糖脱氢生成NADPH， NADPH在340nm有特征吸收峰，NADPH和ATP含量成正比，以此反应ATP含量。 |
ATP含量检测试剂盒（微量法）
产品货号：BA1042
产品规格：100管/96样
产品说明：
ATP广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是生物能量通货，能荷是描述细胞能量代谢状态的主要 参数。测定ATP含量并且计算能荷，能够反映能量代谢状态。
HK催化葡萄糖和ATP合成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化6-磷酸葡萄糖脱氢生成NADPH， NADPH在340nm有特征吸收峰，NADPH和ATP含量成正比，以此反应ATP含量。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
产品内容：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液100mL×1瓶 | 4℃ |
试剂一 | 液体20mL×1瓶 | 4℃ |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | 4℃ |
试剂三 | 液体4mL×1瓶 | 4℃ |
试剂四 | 粉剂×2支 | -20℃ |
试剂五 | 粉剂×1瓶 | 4℃ |
试剂六 | 粉剂×2支 | -20℃ |
标准品 | 粉剂×1支 | -20℃ |
溶液的配制：
1. 试剂二：临用前加入3.5mL蒸馏水充分溶解，可加热促进溶解；
2. 试剂四：临用前取1支加入0.2mL蒸馏水溶解，可分装后-20℃保存，避免反复冻融；
3. 试剂五：临用前加入1mL蒸馏水；
4. 试剂六：临用前取1支加入0.25mL蒸馏水备用，可分装后-20℃保存，避免反复冻融；
5. 标准品：5mg ATP。临用前加入0.826mL蒸馏水配成10μmol/mL的ATP标准溶液；
6. 工作液的配制：临用前请按试剂二(mL)：试剂三(mL)：试剂四(mL)：试剂五(mL)：试剂六(mL)=1：1：0.1： 0.4：0.1的比例配制，现配现用。
技术指标：
Γ低检出限：0.0026μmol/mL
线性范围：0.01953-3μmol/mL
所需的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液枪、微量石英比色皿/ 96孔UV板、研钵/匀浆器、蒸馏水和氯仿。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1. 血清（浆）中ATP的提取：按照血清（浆）体积（mL）：提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议取约0.1mL 血清（浆），加入1mL提取液），充分震荡，10000g，4℃离心10min；取上清液至另一EP管中，加入500μL的氯仿充分震荡混匀，10000g 4℃离心3min，取上清，置冰上待测（不可用于蛋白质含量测定）。
2. 组织中ATP的提取：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆，8000g 4℃离心10min，取上清至另一EP管中，加入500μL的氯仿充分震荡混匀，10000g 4℃离心3min，取上清，置冰上待测（不可用于蛋白质含量测定）。
3. 细胞或细菌中ATP的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎1min（冰浴，强度20％或200W，超声2s，停1s），10000g 4 ℃离心10min；取上清液至另一EP管中，加入500μL的氯仿充 分震荡混匀，10000g 4℃离心3min，取上清，置冰上待测（不可用于蛋白质含量测定）。
二、测定步骤
1. 紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到340nm，蒸馏水调零。
2. 将10μmol/mL的ATP标准溶液用蒸馏水稀释16倍即0.625μmol/mL标准溶液备用。
3. 加样表：在微量石英比色皿或96孔UV板中加入按下表步骤加样：
试剂名称（μL） | 测定管 | 标准管 |
样本 | 20 | - |
标准液 | - | 20 |
试剂一 | 128 | 128 |
工作液 | 52 | 52 |
充分混合后，立即测定340nm下10s的吸光值A1，然后将比色皿连同反应液一起放入37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）水浴中反应3min，拿出擦拭干净立即测定其在3min10s时的吸光值A2。用96孔板则放入37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）培养箱中（酶标仪若自带控温功能，则将温度调至37℃或25℃）。分别计算ΔA测定=A2测定管-A1测定管，ΔA标准=A2标准管-A1标准管。 | ||
三、ATP含量计算
1. 血清（浆）中ATP含量计算
ATP含量(μmol/mL) =ΔA测定÷（ΔA标准÷C标准）×（V提取+V血清（浆））÷V血清（浆）
=6.875×ΔA 测定÷ΔA 标准
2. 组织、细菌或细胞中ATP含量计算
（1） 按样本质量计算
ATP含量（μmol/g质量）= ΔA测定÷（ΔA标准÷C标准）×V提取÷W
=0.625×ΔA测定÷ΔA标准÷W
（2） 按细菌或细胞数量计算
ATP含量(μmol/106cell）=ΔA测定÷（ΔA标准÷C标准）×V提取÷5
=0.125×ΔA测定÷ΔA标准
C标准：标准液浓度，0.625μmol/mL；V提取：加入的提取液体积，1mL；V血清（血浆）：血清（浆）体积， 0.1mL；W：样本质量，g；5：细胞或细菌总数，5×106个。
注意事项：
1. 加入提取液离心后的上清若为浑浊为正常现象。
2. 提取过程严格在冰浴条件下进行。
3. 如果吸光值大于1.5建议将样本用提取液稀释后进行测定。
4. 提取液低温条件下，可能有结晶析出，放于60℃水浴加热溶解即可，不影响使用。
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