SAINT-BIO/尚宝生物 BA1567 菠萝蛋白酶检测试剂盒（福林酚微板法）

菠萝蛋白酶检测试剂盒（福林微板法） 产品货号: BA1567 产品规格: 100T 产品简介： 菠萝蛋白酶(Bromelain)简称菠萝酶，亦称凤梨酶、凤梨酵素等，是存在于菠萝植株中的蛋白水解酶，可从菠 萝果茎、叶、皮提取出来，经精制、提纯、浓缩、酶固定化、冷冻干燥而得到，菠萝蛋白酶已被广泛应用于食品、 医药等行业。利用吸附力、离子键、共价键等不同的联结方式，将酶与不溶性载体联结，制成固定化酶，可以很 好的避免酶的失活，易于储存运输。 菠萝蛋白酶检测试剂盒(福林微板法)检测原理是通过蛋白酶催化底物酪蛋白水解生成酪氨酸，酪氨酸含有酚 羟基，可与福林试剂发生福林反应，即福林试剂在碱性条件下容易定量的被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的 混合物，呈现不同深浅的蓝色。于酶标仪680nm处检测吸光度，吸光度的大小与酪氨酸含量的多少有关，吸光度 大说明酪氨酸含量高，也就是说菠萝蛋白酶分解的酪蛋白多，酶活性高。该试剂盒主要用于检测植物组织尤其是 菠萝匀浆液中菠萝蛋白酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 产品组成： 产品名称 100T 保存条件 试剂（A）：组织匀浆液 500ml 4℃ 试剂（B）：Bromelain Lysis buffer 500ml 4℃，避光 试剂（C）：Bromelain洗脱液 100ml 4℃ 试剂（D）：酪氨酸标准（0.1mg/ml） 1ml 4℃，避光 试剂（E）：酪蛋白溶液 10ml 4℃ 试剂（F）：酪蛋白终止液 30ml 室温，避光 试剂（G）：Bromelain Assay buffer 20ml 室温 试剂（H）：福林试剂 4ml 4℃，避光 自备材料： 1. 蒸馏水 2. 研钵或匀浆器 3. 离心管 4. 离心机 5. 酶标板 6. 酶标仪 操作步骤（仅供参考）： 1. 准备样品： ①植物样品：取10g菠萝肉或植物组织，切碎后在研钵或匀浆器中加入等体积组织匀浆液进行研磨或匀浆，4℃静 置30min，滤纸或4~6层纱布过滤，留取滤液，边搅拌边加入10ml Bromelain Lysis buffer，搅拌约10min，4℃静置 1h，4℃4000r/min离心7~10min，弃上清液，收集沉淀，加入2~3倍体积的Bromelain洗脱液，搅拌洗脱20min。 再次4℃4000r/min离心7~10min，取上清液，-20℃冻存，用于菠萝蛋白酶的检测。 ②固定化酶：称取适量的固定化酶，溶解于0.5ml组织匀浆液，混匀，-20℃冻存待用。 ③高活性样品：如果样品中含有较高活性的菠萝蛋白酶，可以使用蒸馏水或组织匀浆液进行恰当的稀释。 2. 处理待测样品：取两支离心管，按下表顺序依次操作。含有测定液和对照液的离心管室温放置15min， 3000r/min离心7~10min，分别取上清液待用。 单位：ml 样品对照孔 待测样品（提前40℃孵育） 0.1 酪蛋白终止液（提前40℃孵育） 0.3 摇匀灭活。 酪蛋白溶液（提前40℃孵育） 0.1 混匀后40℃准确孵育10min。 单位：ml 样品测定孔 待测样品（提前40℃孵育） 0.1 酪蛋白溶液（提前40℃孵育） 0.1 混匀后40℃准确孵育10min。 酪蛋白终止液（提前40℃孵育） 0.3 摇匀灭活。 3. 稀释系列酪氨酸标准：取适量的酪氨酸标准(0.1mg/ml)，按下表配制不同浓度的酪氨酸标准备用。 加入物质(μl) 1 2 3 4 5 酪氨酸标准(0.1mg/ml) 10 20 30 40 50 蒸馏水 40 30 20 10 0 酪氨酸浓度(mg/ml) 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 4. Bromelain加样：取96孔板，按照下表设置空白孔、标准孔、样品对照孔、样品测定孔，溶液应按照顺序依 次加入，并注意避免产生气泡。如果样品中的菠萝蛋白酶活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行 测定，样品的检测Γ好能设置2平行管，求平均值。 加入物质(μl) 空白孔 标准孔 样品对照孔 样品测定孔 蒸馏水 35 - - - 系列酪氨酸标准(1~5号) - 35 - - 对照液 - - 35 - 测定液 - - - 35 Bromelain Assay buffer 175 175 175 175 福林试剂 35 35 35 35 5. Bromelain测定：充分混匀，40℃孵育显色15min，以对照孔调零，酶标仪测定680nm处测定孔的吸光度；同 时以空白孔调零，酶标仪测定680nm处系列酪氨酸标准(1~5号)孔的吸光度。 计算： 以系列酪氨酸标准(1~5号)浓度(mg/ml)为横坐标，对应的吸光度值为纵坐标，绘制酪氨酸标准曲线，通过样 品测定管的吸光度，在标准曲线上查得各测定孔中酪氨酸浓度。菠萝蛋白酶活性单位的定义：在40℃pH7.0时， 每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量为一个活性单位。其比活力定义：每毫克蛋白所含蛋白酶活力单位 的数量。 菠萝蛋白酶(U)=(测定液的酪氨酸浓度×1000)/15 式中：测定管的酪氨酸浓度单位为mg/ml 1000=μg与mg的单位换算 15=孵育时间15min 注意事项： 1. 待测样品中不能含有酶抑制剂，同时需避免反复冻融。 2. 菠萝蛋白酶提取时，注意低温操作，防止酶活性，亦可-20℃保存。 3. 如果没有酶标仪，也可以使用分光光度计测定。每次检测指标不宜过多，否则操作时间不一，有可能导致样 本间的差异。 4. 离心时Γ好采用低温离心机，常温离心机也可。 5. 酪蛋白终止液有一定腐蚀性，请小心操作。 6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 有效期：6个月有效。4℃运输，4℃保存。