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产品基本说明:
ICDHc(EC 1.1.1.42)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,催化异柠檬酸脱氢脱羧生成α-酮戊二酸,同时还原NADP+生成 NADPH。ICDHc是细胞质中除了磷酸戊糖途径外又一种NADPH重要来源,在逆境中该酶活性通常会发生显著变化。 利用 ICDHc催化NADP+还原成NADPH反应,在340 nm下测定NADPH浓度的增加。 |
胞浆异柠檬酸脱氢酶(ICDHc)活性检测试剂盒
(紫外分光光度法)
产品货号:BA1049
产品规格:50管/48样
产品内容:
提取液:液体100mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:粉剂×1瓶,4℃保存;用时加入50 mL提取液溶解。
试剂二:粉剂×2支,4℃保存;用时每支加275μL双蒸水充分溶解备用。
试剂三:粉剂×2支,4℃保存;用时每支加275μL双蒸水充分溶解备用。
产品说明:
ICDHc(EC 1.1.1.42)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,催化异柠檬酸脱氢脱羧生成α-酮戊二酸,同时还原NADP+生成 NADPH。ICDHc是细胞质中除了磷酸戊糖途径外又一种NADPH重要来源,在逆境中该酶活性通常会发生显著变化。
利用 ICDHc催化NADP+还原成NADPH反应,在340 nm下测定NADPH浓度的增加。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本的前处理:
1、细菌、细胞或组织样品的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每200万细菌或细胞加入400μL提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率20%,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
组织:称取约0.1g组织,加入1mL提取液进行冰浴匀浆。8000g4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样品:直接检测。
二、测定步骤:
1、紫外分光光度计预热30min以上,蒸馏水调零。
2、工作液配制:将试剂一、试剂二、试剂三按85:1:1的比例混合。
3、按下表步骤加样:
试剂名称(μL) | 测定管 |
工作液 | 950 |
样本 | 50 |
将上述试剂按顺序加入1mL石英比色皿中,加样本的同时开始计时,在340 nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1;迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃水浴中,准确反应2分钟;迅速取出比色皿并擦干,记录2分20秒时的吸光度A2。计算ΔA=A2-A1。
三、ICDHc 活力单位的计算:
1、血清(浆)ICDHc 活力的计算:
单位的定义:每mL血清(浆)在反应体系中每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
ICDHc(U/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样本÷T=1608×ΔA
2、组织中 ICDHc 活力的计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
ICDHc(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样本×Cpr)÷T=1608×ΔA÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
ICDHc(U/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W÷V提取×V样本)÷T=1608×ΔA÷W
3、细菌或培养细胞中 ICDHc 活力的计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
ICDHc(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样本×Cpr)÷T=1608×ΔA÷Cpr
(2)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
ICDHc(U/104 Cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样本×500)÷T=3.2×ΔA÷Cpr
V反总:反应总体积,0.001L;ε:NADPH摩尔消光系数,6.22×103L/moL/cm;d:石英比色皿光径,1cm;V样本:加入样本体积,0.05mL;V提取:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本鲜重,g;T:反应时间,2min;500:细菌或细胞密度,104个/mL。
注意事项:
1、若A2-A1大于0.5,需将酶液用提取液稀释,使A2-A1小于0.5,可提高检测灵敏度。若初始值A1大于0.5可尝试将酶液用提取液稀释。
2、实验时,试剂二、试剂三和样本在冰上放置,以免变性和失活;工作液37℃水浴放置。
3、比色皿中反应液的温度必须保持37℃,取小烧杯一只装入一定量的37℃蒸馏水,将此烧杯放入37℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
4、Γ好两个人同时做此实验,一个人比色,一个人计时,以保证实验结果的准确性。
产品介绍: