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产品基本说明：
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ICDHc（EC 1.1.1.42）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化异柠檬酸脱氢脱羧生成α-酮戊二酸，同时还原NADP+生成NADPH。ICDHc是细胞质中除了磷酸戊糖途径外又一种NADPH重要来源，在逆境中该酶活性通常会发生显著变化。 利用ICDHc催化NADP+还原成NADPH反应，在340nm下测定NADPH浓度的增加，即可反映ICDHc活性。 |
胞浆异柠檬酸脱氢酶（ICDHc）活性检测试剂盒（微量法）
产品货号：BA1050
产品规格：100管/96样
产品说明：
ICDHc（EC 1.1.1.42）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化异柠檬酸脱氢脱羧生成α-酮戊二酸，同时还原NADP+生成NADPH。ICDHc是细胞质中除了磷酸戊糖途径外又一种NADPH重要来源，在逆境中该酶活性通常会发生显著变化。
利用ICDHc催化NADP+还原成NADPH反应，在340nm下测定NADPH浓度的增加，即可反映ICDHc活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
产品内容：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体120mL×1瓶 | 4℃ |
试剂一 | 粉剂×1瓶 | 4℃ |
试剂二 | 粉剂×1支 | 4℃ |
试剂三 | 粉剂×1支 | 4℃ |
溶液的配制：
1. 试剂一：用时加入20mL提取液溶解；
2. 试剂二：用时每支加275μL双蒸水充分溶解备用；
3. 试剂三：用时每支加275μL双蒸水充分溶解备用；
4. 工作液配制：将试剂一、试剂二、试剂三按85：1：1的比例混合，现用现配。
所需的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、研钵/匀浆器、 冰和蒸馏水。
测定步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1. 细菌、细胞或组织样本的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每200万细菌或细胞加入400μL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2. 血清（浆）样本：直接检测。
二、测定步骤
1. 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2. 按下表步骤加样：
试剂名称（μL） | 测定管 |
工作液 | 190 |
样本 | 10 |
将上述试剂按顺序加入微量石英比色皿/石英96孔板中，加样本的同时开始计时，在340nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1；迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃水浴中，准确反应2分钟（酶标仪有控温功能，可以将温度调至37℃）；迅速取出比色皿并擦干，记录2分20秒时的吸光度A2。计算ΔA=A2-A1。）
三、ICDHc活力单位的计算
a、按微量石英比色皿计算：
1. 血清（浆）ICDHc活力的计算
单位的定义：每mL血清（浆）在反应体系中每分钟生成1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
ICDHc（U/mL）=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样本÷T=1608×ΔA
2. 组织中ICDHc活力的计算
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
ICDHc（U/mg prot）=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样本×Cpr)÷T=1608×ΔA÷Cpr
（2）按样本质量计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟生成1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
ICDHc（U/g质量）=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W÷V提取×V样本) ÷T=1608×ΔA÷W
3. 细菌或培养细胞中ICDHc活力的计算
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。
ICDHc（U/mg prot）=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样本×Cpr)÷T=1608×ΔA÷Cpr
（2）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
ICDHc（U/104 Cell）=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样本×500)÷T=3.2×ΔA
V反总：反应总体积，2×10-4L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103L/moL/cm；d：石英比色皿光径，1cm； V样本：加入样本体积，0.01mL；V提取：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量， g；T：反应时间，2min；500：细菌或细胞密度，500万/mL。
b、按96孔板（UV板）计算：
将上述公式中光径d-1cm改为d-0.6cm（96孔板光径）进行计算即可。
注意事项：
1. 若A2-A1大于0.5，需将酶液用提取液稀释，使A2-A1小于0.5，可提高检测灵敏度。若初始值A1大于0.5可尝试将酶液用提取液稀释。
2. 实验时，试剂二、试剂三和样本在冰上放置，以免变性和失活；工作液37℃水浴放置。
3. 比色皿中反应液的温度必须保持37℃，取小烧杯一只装入一定量的 37℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
4. Γ好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。
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