SAINT-BIO/尚宝生物 BA1056 丙酮酸脱羧酶（PDC）活性检测试剂盒（微量法）

丙酮酸脱羧酶（PDC）活性检测试剂盒（微量法）

产品货号：BA1056

产品规格：100管/96样

产品说明：

PDC主要存在于酵母中，是乙醇发酵的关键酶之一，催化丙酮酸脱羧生成乙醛。

PDC催化丙酮酸脱羧生成乙醛，添加乙醇脱氢酶（ADH）来进一步催化NADH还原乙醛生成乙醇和NAD+；NADH在340nm有吸收峰，而NAD+没有；通过测定340nm光吸收下降速率，来计算PDC活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容：

溶液的配制：

1. 提取液：内含不溶物，使用前摇匀；

2. 混合试剂：临用前配制，将试剂三和试剂四用适量试剂二溶解后再全部转移到试剂二中备用。

所需的仪器和用品：

台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、微量石英比色皿/ 96孔（UV板）、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 细胞或细菌样本的制备：

先收集细胞或细菌样本到离心管内，弃上清，按照每500万细胞或细菌加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次）。10000rpm，4℃离心20min，取上清，置冰上待测。

2. 组织样本：

称取约0.1g组织，加入1mL提取液，冰上充分研磨。16000g，4℃离心20min，取上清，置冰上待测。

3. 血清（浆）样本：直接检测。

测定步骤

1. 紫外分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2. 试剂一37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）水浴提前预热30min。

3. 操作表：

迅速混匀后于340nm比色，记录10s和70s的吸光值，测定管的记为A1和A2，空白管的记为A3和A4，计算ΔA=（A1-A2）-（A3-A4）。（空白管只需做1-2次）

PDC活性计算

A. 使用微量石英比色皿测定的计算： 

1. 血清（浆）PCD活力的计算：

单位的定义：37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）中，每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟催化1μmol NADH 氧化定义为一个酶活力单位。

PDC（U/mL）=ΔA×V反总÷(ε×d)×10 6÷V样本÷T=1.6×ΔA

2. 组织中PDC活力的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）中，每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化1μmol NADH氧化定义为一个酶活力单位。

PDC（U/mg prot）=ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁶÷(V样本×Cpr)÷T=1.6×ΔA÷Cpr

（2）按样本质量计算：

单位的定义：37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）中，每g组织质量在反应体系中每分钟催化1μmol NADH氧化定义为一个酶活力单位。

PDC（U/g 质量）=ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁶÷ (W÷V提取×V样本)÷T=1.6×ΔA÷W

3. 细菌或细胞中PDC活力的计算：

按细菌或细胞数量计算：

单位的定义：37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）中，每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化1μmol的NADH氧化定义为一个酶活力单位。

PDC（U/10⁴Cell）= ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁶÷(V样本÷V提取×500)÷T =3.2×10 -3×ΔA÷Cpr

ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，0.2mL=2×10^-4L， V样本：加入反应体系中上清液体积，0.02mL；Cpr：蛋白浓度（mg/mL），需要另外测定；T：反应时间，1min； W：样本质量，g；V提取：提取液体积，1mL；500：细菌或细胞总数，500万；10⁶：单位换算系数，1mol=10⁶μmol。 B.使用96孔UV板测定的计算： 

将上述公式中的d-1cm（比色皿光径）换为d-0.6cm（96孔板光径）进行计算即可。

注意事项：

1. 实验时，混合试剂、试剂五和样本在冰上放置，以免变性和失活。

2. 比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

3. Γ好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。使用96孔板测定时不推荐 同时测多个样本。

4. 如果1分钟变化值较小可延长反应时间，同时注意修改计算公式。