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产品基本说明:
丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase,PC,EC 6.4.1.1)广泛存在于动物、霉菌和酵母的线粒体中,但在植物体和大部分细菌中却不含此酶。是供给草酰乙酸的主要补充反应,是糖异生过程的Γ个限速酶。 PC不可逆的催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi,苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH生成苹果酸和NAD+,在340nm下测定NADH氧化速率,即可反映PC活性。 |
丙酮酸羧化酶(PC)检测试剂盒(紫外分光光度法)
产品货号:BA1057
产品规格:50管/48样
产品说明:
丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase,PC,EC 6.4.1.1)广泛存在于动物、霉菌和酵母的线粒体中,但在植物体和大部分细菌中却不含此酶。是供给草酰乙酸的主要补充反应,是糖异生过程的Γ个限速酶。
PC不可逆的催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi,苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH生成苹果酸和NAD+,在340nm下测定NADH氧化速率,即可反映PC活性。
注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
产品内容:
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液110mL×1瓶 | 4℃ |
试剂一 | 液体30mL×1瓶 | 4℃ |
试剂二 | 液体10mL×1瓶 | 4℃ |
试剂三 | 粉剂×1瓶 | -20℃ |
试剂四 | 粉剂×1瓶 | -20℃ |
试剂五 | 液体5mL×1瓶 | 4℃ |
试剂六 | 液体15μL×1支 | 4℃ |
试剂六稀释液 | 液体10mL×1支 | 4℃ |
溶液的配制:
1. 试剂三:临用前加入5mL蒸馏水溶解;可分装后-20℃保存,避免反复冻融;
2. 试剂四:临用前加入5mL蒸馏水溶解;可分装后-20℃保存,避免反复冻融;
3. 试剂六:液体置于试剂瓶内EP管中。临用前按试剂六:试剂六稀释液=1.6:660(V:V)的比例稀释试剂六备用,现用现配;
4. 工作液的配制:按照试剂二:试剂三:试剂四=2:1:1的体积比例充分混匀,现用现配。
所需的仪器和用品:
紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1. 称取约0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL提取液,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2. 4℃1000g离心10min。将上清液移至另一离心管中,4℃11000g 离心15min。
3. 上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的PC(此步可选做,可以判断线粒体提取效果)。
4. 在沉淀中加入1mL提取液,超声波破碎(功率20%,超声5秒,间隔10秒,重复12次),用于PC活性测定,并且用于蛋白含量测定。
二、测定步骤
1. 分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2. 试剂一用前37℃孵育15min。
3. 操作表:在1mL石英比色皿中分别加入下列试剂:
试剂名称(μL) | 测定管 | 空白管 |
试剂一 | 450 | 450 |
工作液 | 320 | 320 |
试剂五 | 80 | 80 |
试剂六 | 100 | 100 |
样本 | 50 | |
蒸馏水 | 50 | |
在1mL石英比色皿中分别加入上述试剂,充分混匀后于340nm处测定10s时的吸光值A1,迅速置于37℃(哺乳动物)水2min,拿出迅速擦干测定130s时的吸光值A2,计算ΔA测定管=A1测定-A2测定,ΔA空白管=A1空白-A2空白,ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管。(空白管只需做1-2次) |
三、PDC活性计算
单位的定义:每毫克蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PC酶活(U/mg prot)= ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷(V样×Cpr)÷T=1607×ΔA÷Cpr
ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V反总:反应体系总体积,1×10-3L;V样:反应体系中样本体积,0.05mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;T:反应时间:2min;109:单位换算系数,1mol=109nmol。
注意事项:
1. 为保证实验结果的准确性,需先取1-2个样做预实验,ΔA大于0.8时,建议将粗酶液用提取液稀释后再进行测定。当ΔA小于0.01时,可以延长反应时间(5min或10min)来测定。
2. 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔,正常情况下,变化不超过0.05。
3. 样本的蛋白浓度需自行测定,由于提取液中含有较高的蛋白浓度(约1mg/mL),所以测定样本蛋白浓度时需扣除提取液自身蛋白浓度。
4. 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活,若用样本质量计算,则需加测胞浆提取物酶活,上清和沉淀酶活之和方为总酶活。
5. 本试剂盒试剂足够完成50管反应。
6. 附:使用样本重量计算公式:(样本检测数为50T/24S)。
A、上清中PC活力的计算:
酶活定义:每克样本每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PC酶活(U/g质量)=ΔA1÷(ε×d)×109×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T= 1607×ΔA1÷W
ΔA1:上清测定值;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V反总:反应体系总体积,1×10-3L;V样:反应体系中样本体积,0.05mL;V提取:加入的提取液体积,1mL;T:反应时间:2min; W:样本质量,g;109:单位换算系数,1mol=109nmol。
B、沉淀中PC活力的计算:
酶活定义:每克样本每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PC酶活(U/g质量)=ΔA2÷(ε×d)×109×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T = 1607×ΔA2÷W
ΔA2:上清测定值;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V反总:反应体系总体积,1×10-3L;V样:反应体系中样本体积,0.05mL;V提取:沉淀重悬体积,1mL;T:反应时间:2min;W:样本质量,g;109:单位换算系数,1mol=109nmol。
C、样本PC总活力的计算:
样本PC总活力即为上清中PC活力与沉淀中PC活力之和。
按样本质量计算:PC(U/g质量)=1607×ΔA1÷W+1607×ΔA2÷W
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