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产品基本说明：
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丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC，EC 6.4.1.1)广泛存在于动物、霉菌和酵母的线粒体中，但在植物体和大部分细菌中却不含此酶。是供给草酰乙酸的主要补充反应，是糖异生过程的Γ个限速酶。 PC不可逆的催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi，苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH生成苹果酸和NAD+，在340nm下测定NADH氧化速率，即可反映PC活性。 |
丙酮酸羧化酶（PC）检测试剂盒（微量法）
产品货号：BA1058
产品规格：100管/96样
产品说明：
丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC，EC 6.4.1.1)广泛存在于动物、霉菌和酵母的线粒体中，但在植物体和大部分细菌中却不含此酶。是供给草酰乙酸的主要补充反应，是糖异生过程的Γ个限速酶。
PC不可逆的催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi，苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH生成苹果酸和NAD+，在340nm下测定NADH氧化速率，即可反映PC活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
产品内容：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液110mL×2瓶 | 4℃ |
试剂一 | 液体15mL×1瓶 | 4℃ |
试剂二 | 液体5mL×1瓶 | 4℃ |
试剂三 | 粉剂×1瓶 | -20℃ |
试剂四 | 粉剂×1瓶 | -20℃ |
试剂五 | 液体2mL×1瓶 | 4℃ |
试剂六 | 液体5μL×1支 | 4℃ |
试剂六稀释液 | 液体5mL×1支 | 4℃ |
溶液的配制：
1. 试剂三：临用前加入3mL蒸馏水溶解；可分装后-20℃保存，避免反复冻融；
2. 试剂四：临用前加入2mL蒸馏水溶解；可分装后-20℃保存，避免反复冻融；
3. 试剂六：液体置于试剂瓶内EP管中。临用前按试剂六：试剂六稀释液=1:428（V:V）的比例稀释试剂六备用，现用现配；
4. 工作液的配制：按照试剂二：试剂三：试剂四=2:1:1的体积比例充分混匀，现用现配。
所需的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、 冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1.0mL提取液，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
4℃1000g离心10min。将上清液移至另一离心管中，4℃11000g离心15min。
上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的PC（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。
在沉淀中加入1mL提取液，超声波破碎（功率20%，超声5秒，间隔10秒，重复12次），用于PC活性测定，并且用于蛋白含量测定。
二、测定步骤
1. 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2. 试剂一用前37℃孵育15min。
3. 操作表：
试剂名称（μL） | 空白管 | 测定管 |
试剂一 | 90 | 90 |
工作液 | 64 | 64 |
试剂五 | 16 | 16 |
试剂六 | 20 | 20 |
样本 | 10 | |
蒸馏水 | 10 | |
在微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入上述试剂，充分混匀后于340nm处测定10s时的吸光值A1，迅速置于37℃水浴或培养箱2min（酶标仪有控温功能可将温度调至37℃），拿出迅速擦干测定130s时的吸光值A2，计算ΔA测定管=A1测定-A2测定，ΔA空白管=A1空白-A2空白，ΔA=ΔA测定管-ΔA 空白管。（空白管只需做1-2次） | ||
二、PC酶活计算
1. 按微量石英比色皿计算：
单位的定义：每毫克蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PC酶活（U/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×109×V反总÷（V样×Cpr）÷T= 1607×ΔA÷Cpr
ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，2×10-4L；V样：反应体系中样本体积，0.01mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间：2min。
2. 按96孔UV板计算： 将上述计算公式中的d-1cm改为d-0.6cm进行计算即可。
注意事项：
1. 为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，ΔA大于0.8时（96孔UV板测定时ΔA大于0.5时），建议将粗酶液用提取液稀释后再进行测定。当ΔA小于0.01时，可以延长反应时间（5min或10min）来测定。
2. 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过0.05。
3. 样本的蛋白浓度需自行测定，由于提取液中含有较高的蛋白浓度（约1mg/mL），所以测定样本蛋白浓度时需扣除提取液自身蛋白浓度。
4. 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。
5. 本试剂盒试剂足够完成100管反应。
6. 附:使用样本重量计算公式：（样本检测数为100T/48S）。
（1）按微量石英比色皿计算：
A、上清中PC活力的计算:
酶活定义：每克样本每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PC酶活（U/g质量）=ΔA1÷（ε×d）×109×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T= 1607×ΔA1÷W
ΔA1：上清测定值；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，2×10-4L；V样：反应体系中样本体积，0.01mL；V提取：加入的提取液体积，1mL；T：反应时间：2min； W：样本质量，g。
B、沉淀中PC活力的计算:
酶活定义：每克样本每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
PC酶活（U/g质量）=ΔA2÷（ε×d）×109×V反总÷（V样×W÷V样总）÷T = 1607×ΔA2÷W
ΔA2：上清测定值；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，2×10-4L；V样：反应体系中样本体积，0.01mL；V提取：沉淀重悬体积，1mL；T：反应时间：2min；W：样本质量，g。
C、样本PC总活力的计算:
样本PC总活力即为上清中PC活力与沉淀中PC活力之和。
按样本质量计算：
PC（U/g质量）=1607×ΔA1÷W+1607×ΔA2÷W
（2）按96孔UV板计算：
将上述计算公式中的d-1cm改为d-0.6cm进行计算即可。
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