SAINT-BIO/尚宝生物 BA1059 丙酮酸脱氢酶（PDH）活性检测试剂盒（可见分光光度法）

丙酮酸脱氢酶（PDH）活性检测试剂盒（可见分光光度法）

产品货号：BA1059

产品规格：50管/48样

产品说明：

PDH（EC 4.1.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是丙酮酸脱氢酶复合体(PDHC)催化丙酮酸氧化脱羧的限速酶，催化丙酮酸脱梭生成羟乙基-TPP，把糖酵解和三羧酸循环连接起来。PDH催化丙酮酸脱氢，同时还原2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），从而导致605nm光吸收的减少。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容： 

溶液的配制：  

1. 试剂二：为易挥发试剂，用完后尽快密封，-20℃保存。

2. 试剂六：每支试剂六加入1mL蒸馏水溶解备用。

3. 工作液的配制：临用前把11.5mL试剂四、一支试剂五、0.9mL试剂六、3.5mL试剂七转移到一瓶试剂三中混合溶解待用；用不完的试剂-20℃分装保存，可以保存4周。

所需的仪器和用品：

可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

组织：称取约0.1g组织，加入1mL试剂一和10μL试剂二，用冰浴匀浆器或研钵匀浆充分研磨，4℃ 11000g离心10min，取上清，置冰上待测。

细胞或者细菌样本：先收集500万细胞到离心管内，离心后弃上清；之后加入1mL试剂一和10μL试剂二，冰浴超声波破碎细菌（功率20%或200W，超声3 s，间隔7 s，总时间5min）；然后11000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

血清（浆）：直接检测。

二、测定步骤

1. 分光光度计预热30min以上，调节波长至605nm，蒸馏水调零。

2. 每个样本需要900μL工作液，按样本数＋1取出一定量的工作液于37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）中孵育5min。

3. 空白管：在1mL比色皿中加入900µL工作液和50µL水，混匀，立即记录605nm处初始吸光值A1和1min后的吸光值 A2，计算ΔA空白=A1-A2。

4. 测定管：在1mL比色皿中加入900µL工作液和50µL样本，混匀，立即记录605nm处初始吸光值A3和1min后的吸光值A4，计算ΔA测定=A3-A4。

三、PDH活性计算 

1. 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

PDH活性（U/mg prot）=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T

=904.762×(ΔA测定-ΔA空白)÷Cpr

2. 按样本质量计算

单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

PDH活性(U/g质量)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V样÷V样总)÷T

=913.81×(ΔA测定-ΔA空白)÷W

3. 按细菌或细胞数量计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

PDH活性(U/10⁴cell)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T

=1.828×(ΔA测定-ΔA空白)

4. 按样本体积计算

单位的定义：每mL液体每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

PDH活性(U/mL)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷V样÷T=904.762×(ΔA测定-ΔA空白) 

V反总：反应体系总体积，9.5×10^-4L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×10⁴L/mol/cm；d：比色皿光径， 1cm；V样：加入样本体积，0.05mL；V样总：加入试剂一和试剂二体积，1.01mL；T：反应时间，1min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

注意事项：

1. 测定过程中所有样本在冰上放置并于2小时内检测，以免变性和失活。

2. 测定管的ΔA值在0.01-0.25之间，若测定管的ΔA值大于0.25，需将样本进行稀释。

3. 由于试剂一中含有一定浓度的蛋白（约1mg/mL），所以在测定样品蛋白浓度时需要减去本身的蛋白含量。