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产品基本说明:
PDH(EC 4.1.1.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是丙酮酸脱氢酶复合体(PDHC)催化丙酮酸氧化脱羧的限速酶,催化丙酮酸脱梭生成羟乙基-TPP,把糖酵解和三羧酸循环连接起来。 PDH催化丙酮酸脱氢,同时还原2,6-二氯酚靛酚(2,6-DCPIP),从而导致605nm光吸收的减少。 |
丙酮酸脱氢酶(PDH)活性检测试剂盒(微量法)
产品货号:BA1060
产品规格:100管/96样
产品说明:
PDH(EC 4.1.1.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是丙酮酸脱氢酶复合体(PDHC)催化丙酮酸氧化脱羧的限速酶,催化丙酮酸脱梭生成羟乙基-TPP,把糖酵解和三羧酸循环连接起来。
PDH催化丙酮酸脱氢,同时还原2,6-二氯酚靛酚(2,6-DCPIP),从而导致605nm光吸收的减少。
注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
产品内容:
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
试剂一 | 液体110mL×1瓶 | 4℃ |
试剂二 | 液体0.6mL×1瓶 | -20℃ |
试剂三 | 液体7.5mL×2瓶 | 4℃ |
试剂四 | 液体13mL×1瓶 | 4℃ |
试剂五 | 粉剂×2支 | -20℃ |
试剂六 | 液体1mL×1支 | 4℃ |
试剂七 | 液体4mL×1瓶 | 4℃ |
溶液的配制:
试剂二:为易挥发试剂,用完后尽快密封,-20℃保存。
工作液的配制:临用前把5.75mL试剂四、一支试剂五、0.45mL试剂六、1.75mL试剂七转移到一瓶试剂三中混合溶解待用(共15.45mL,约85T);用不完的试剂-20℃分装保存,可保存4周。避免反复冻融。
所需的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
组织:称取约0.1g组织,加入1mL试剂一和10μL试剂二,用冰浴匀浆器或研钵匀浆充分研磨,4℃ 11000g离心10min,取上清,置冰上待测。
细胞或者细菌样本:先收集500万细胞或细菌到离心管内,离心后弃上清;之后加入1mL试剂一和10μL试剂二,冰浴超声波破碎细菌(功率200W,超声3s,间隔7s,总时间5min);然后11000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。
血清(浆)及其它液体样本:直接检测。若溶液有浑浊则离心后去上清进行测定。
二、测定步骤
1. 分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至605nm,分光光度计蒸馏水调零。
2. 每个样本需要180μL工作液,按样本数取出一定量的工作液于37℃(哺乳动物)或25℃(其他物种)中水浴10min。
3. 空白管:在微量比色皿或96孔板中加入180µL工作液和10µL水,混匀,立即记录605nm处10s处吸光值A1和 1min10s后的吸光值A2,计算ΔA空白=A1-A2。空白管只需测1-2次。
4. 测定管:在微量比色皿或96孔板中加入180µL工作液和10µL样本,混匀,立即记录605nm处10s处吸光值A3和1min10s后的吸光值A4,计算ΔA测定=A3-A4。
三、PDH活性计算
a.用微量比色皿测定的计算公式如下
1. 按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH活性(U/mg prot)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T
=904.762×(ΔA测定-ΔA空白)÷Cpr
2. 按样本质量计算
单位的定义:每g组织每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH活性(U/g质量)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)÷T
=913.81×(ΔA测定-ΔA空白)÷W
3. 按细菌或细胞数量计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH活性(U/104cell)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T
=1.828×(ΔA测定-ΔA空白)
4. 按样本体积计算
单位的定义:每mL液体在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH活性(U/mL)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×109 ]÷V样÷T =904.762×(ΔA测定-ΔA空白)
V反总:反应体系总体积,1.9×10-4L;ε:2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数,2.1×104L/mol/cm;d:比色皿光径, 1cm;V样:加入样本体积,0.01mL;V样总:加入试剂一和试剂二体积,1.01mL;T:反应时间,1min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。
b. 用96孔板测定的计算公式如下
1. 按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH活性(U/mg prot)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样) ÷T
=1809.524×(ΔA测定-ΔA空白)÷Cpr
2. 按样本质量计算
单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH活性(U/g质量)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×W) ÷T
=1827.62×(ΔA测定-ΔA空白)÷W
3. 按细菌或细胞数量计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH活性(U/104cell)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×500) ÷T
=3.655×(ΔA测定-ΔA空白)
4. 按样本体积计算
单位的定义:每mL液体在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH活性(U/mL)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×109 ]÷V样÷T
=1809.524×(ΔA测定-ΔA空白)
V反总:反应体系总体积,1.9×10 -4L;ε:2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数,2.1×104L/mol/ cm;d:96孔板光径, 0.5cm;V样:加入样本体积,0.01mL;V样总:加入试剂一和试剂二体积,1.01mL;T:反应时间,1min;Cpr: 样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。
注意事项:
1. 测定过程中所有样本在冰上放置并于2小时内检测,以免变性和失活。
2. 测定管的ΔA值在0.01-0.25之间,若测定管的ΔA值大于0.25,需将样本进行稀释。 计算公式中乘以稀释倍数。 若测定管的ΔA值小于0.01,需加大样本量后重新测定,注意同步修改计算公式。
3. 由于试剂一中含有一定浓度的蛋白(约1mg/mL),所以在测定样品蛋白浓度时需要减去试剂一的蛋白含量。
产品介绍: