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产品基本说明:
氧自由基作用于脂质的不饱和脂肪酸,生成过氧化脂质;后者逐渐分解为一系列复杂的化合物,其中包括丙 二醛(MDA)。通过检测MDA的水平即可检测脂质氧化的水平。 |
丙二醛(MDA)含量检测试剂盒(可见分光光度法)
产品货号:BA1065
产品规格:50管/48样
产品说明:
氧自由基作用于脂质的不饱和脂肪酸,生成过氧化脂质;后者逐渐分解为一系列复杂的化合物,其中包括丙 二醛(MDA)。通过检测MDA的水平即可检测脂质氧化的水平。
丙二醛(MDA)在酸性和高温条件下,可以与硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)缩合,生成棕红色的三甲川(3,5,5-三甲基恶唑-2,4-二酮),其Γ大吸收波长在532nm。进行比色后可估测样本中过氧化脂质的含量。 但是测定动植物组织中MDA时受多种物质的干扰,其中Γ主要的是可溶性糖,其与TBA显色反应产物的Γ大吸 收波长在450nm,但532nm处也有吸收。所以同时测定600nm、532nm、450nm下的吸光度,利用532nm与450nm、 600nm下的吸光度的差值计算MDA的含量。
由于植物中受蔗糖干扰较大,动物中受葡萄糖干扰较大,所以本试剂盒有针对蔗糖和葡萄糖的两个公式。若所测样本为油脂类物质,则两个公式均可。
注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
产品内容:
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液50mL×1瓶 | 4℃ |
试剂一 | 液体30mL×1瓶 | 4℃ |
试剂二 | 粉剂×2瓶 | 4℃ |
试剂三 | 液体10mL×1瓶 | 4℃ |
溶液的配制:
1. MDA检测工作液的配制:用时在每瓶试剂二中加入15mL试剂一,溶解混匀,4℃保存待用。MDA检测工作液较难溶解,可以70℃加热,并剧烈振荡以促进溶解,或者通过超声处理以促进溶解。
所需的仪器和用品:
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1. 细菌、细胞样本的制备:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率20%,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2. 组织样本的制备:称取约0.1g组织,加入1mL提取液进行冰浴匀浆;8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
3. 血清(浆):直接检测。
二、测定步骤
1. 分光光度计预热30min以上,蒸馏水调零。
2. 按下表步骤加样:
试剂名称(μL) | 测定管 | 空白管 |
MDA 检测工作液 | 600 | 600 |
蒸馏水 | - | 200 |
样本 | 200 | - |
试剂三 | 200 | 200 |
混合液在100℃水浴中保温60min后(盖紧,防止水分散失),置于冰浴中冷却,10000g,常温,离心10min。 取上清至1mL玻璃比色皿中,测定各样本在450nm、532nm和600nm处的吸光度,分别计算ΔA450=A450测定-A450空白,ΔA532=A532测定-A532空白,ΔA600=A600测定-A600空白。(空白管只需做1-2次)
三、MDA含量计算
1. 细菌、细胞或动物组织中MDA含量计算
(1)按照蛋白浓度计算
MDA含量(nmol/mg prot)=(6.45 ×(ΔA532-ΔA600)-1.29×ΔA450)×V 总÷(Cpr×V样本)
=5×(6.45 ×(ΔA532-A600)-1.29×ΔA450)÷Cpr
(2)按照样本质量计算
MDA含量(nmol/g质量)=(6.45 ×(ΔA532-ΔA600)-1.29×A450)×V 总÷(W×V样本÷V提取)
=5×(6.45 ×(ΔA532-ΔA600)-1.29×ΔA450)÷W
(3)按照细菌或细胞数量计算
MDA含量(nmol/104 cell)=(6.45 ×(ΔA532-ΔA600)-1.29×ΔA450)×V总÷(500×V样本÷V提取)
=0.01×(6.45 ×(ΔA532-ΔA600)-1.29×A450)
(4)按照血清(浆)体积计算
MDA含量(nmol/mL)=(6.45×(ΔA532-ΔA600)-1.29×ΔA450)×V总÷V样本
=5×(6.45×(ΔA532 -ΔA600)-1.29×ΔA450)
V总:反应体系总体积,1mL;V样本:加入样本体积,0.2mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万;V提取:提取液体积,1mL。
2. 植物组织中MDA含量计算
(1)按照样本质量计算
MDA含量(nmol/g 质量)=(6.45 ×(ΔA532-ΔA600)-0.56×ΔA450)×V总÷(W×V样本÷V提取)
=5×(6.45 ×(ΔA532-ΔA600)-0.56×ΔA450)÷W
(2)按照蛋白浓度计算
MDA含量(nmol/mg prot)=(6.45 ×(ΔA532-ΔA600)-0.56×ΔA450)×V总÷(Cpr×V样本)
=5×(6.45 ×(ΔA532-ΔA600)-0.56×ΔA450)÷Cpr
V总:反应体系总体积,1mL;V样本:加入样本体积,0.2mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;V提取:提取液体积,1mL。
注意事项:
若发现检测样本吸光值过低,可以将沸水浴时间60min调整为90min或者更长,但同一实验中的MDA的检测都需要延长到同一时间以免引起误差。
产品介绍: