SAINT-BIO/尚宝生物 BA1040 Ca2+ Mg2+--ATP酶活性检测试剂盒（微量法）

Ca++Mg++-ATP 酶活性检测试剂盒（微量法） 产品货号：BA1040 产品规格：100管/48样 产品说明： Ca++Mg++- ATP酶广泛分布于植物、动物、微生物和细胞中，可催化ATP水解生成ADP和无机磷。 根据Ca++Mg++-ATP酶分解ATP生成ADP及无机磷，通过测定无机磷的量来确定ATP酶活性高低。 注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增 加样本量进行检测。 产品内容： 试剂名称 规格 保存条件 试剂一 液体60mL×1瓶 2-8℃ 试剂二 液体4mL×1瓶 2-8℃ 试剂三 粉剂×2支 -20℃ 试剂四 液体2mL×1瓶 2-8℃ 试剂五 液体3mL×1瓶 2-8℃ 试剂六 粉剂×1瓶 2-8℃ 试剂七 粉剂×1瓶 2-8℃ 试剂八 液体5mL×1瓶 室温 标准品 液体1mL×1支 2-8℃ 溶液的配制： 1. 试剂三：用时取1支加1mL蒸馏水，现用现配。用不完的试剂-20℃分装保存一周。 2. 试剂六：用时加入5mL蒸馏水，溶解后2-8℃保存两周。 3. 试剂七：用时加入5mL蒸馏水，溶解后2-8℃保存两周。 4. 标准品：10mmol/L标准磷贮备液。将标准品20倍稀释，即取0.1mL标准品加1.9mL蒸馏水充分混匀， 配成0.5 μmol/mL标准磷应用液，现配现用。 5. 定磷剂的配制：按H2O：试剂六：试剂七：试剂八=2:1:1:1（体积比）的比例配制，配好的定磷剂应为浅黄色。 若变色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂根据实验用量现用现配。 6. 注意：配试剂Γ好用新的烧杯、玻璃棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。 需自备的仪器和用品： 可见分光光度计/酶标仪、水浴锅/恒温培养箱、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/ 匀浆器、冰和蒸馏水。 操作步骤： 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） ： 1. 细菌、细胞或组织样品的制备： 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 试剂一， 超声波破碎细菌或细胞（功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上 待测。 组织：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 2. 血清（浆）样品：直接检测。 二、测定步骤 1. 可见分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 660nm，可见分光光度计需用蒸馏水调零。 2. 酶促反应（在 EP 管中加入下列试剂） 3. 定磷（在 EP 管或 96 孔板中加入下列试剂） 试剂名称 空白管 标准管 对照管 测定管 0.5μmol/mL 标准磷应用液（μL） - 20 - - 上清液（μL） - - 20 20 蒸馏水（μL） 20 - - - 定磷试剂（μL） 200 200 200 200 混匀，40℃水浴 10min，冷却至室温，在 660nm 处，记录各管吸光值。计算ΔA 测定=A 测定管-A 对照管， ΔA 标准= A 标准管-A 空白管。每个测定管需设一个对照管，标准管和空白管只需测 1-2 次。 三、Ca++Mg++-ATPase 活力的计算 1. 血清（浆）Ca++Mg++-ATPase活力的计算： 定义：规定每小时每毫升血清（浆）中Ca++Mg++-ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。 Ca++Mg++-ATP酶活力（U/mL）= C标准管×ΔA测定÷ΔA标准×V总÷V样÷T =7.5×ΔA测定÷ΔA标准 2. 组织、细菌或细胞中中Ca++Mg++-ATPase活力的计算： （1）按蛋白浓度计算： 定义：规定每小时每毫克组织蛋白中中Ca++Mg++-ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。 Ca++Mg++-ATP酶活力(U/mg prot)=C标准管×ΔA测定÷ΔA标准×V总÷（Cpr×V样）÷T=7.5×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr （2）按样本鲜重计算： 定义：规定每小时每克组织中Ca++Mg++-ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。 试剂名称 对照管 测定管 试剂一（μL） 65 45 试剂二（μL） 40 40 试剂三（μL） 20 20 试剂四（μL） - 20 样品（μL） - 100 混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其他物种）准确水浴 10min 试剂五（μL） 25 25 样品（μL） 100 - 混匀，4000g，常温离心 10min，取上清液 Ca++Mg++-ATP酶活力(U/g 质量)=C标准管×ΔA测定÷ΔA标准×V总÷(V样÷V样总×W)÷T =7.5×ΔA测定÷ΔA标准÷W （3）按细菌或细胞密度计算： 定义：规定每小时每1万个细菌或细胞中Ca++Mg++-ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。 Ca++Mg++-ATP酶活力(U/10 4 cell)=C标准管×ΔA测定÷ΔA标准×V总÷(V样÷V样总×500)÷T =0.015×ΔA测定÷ΔA标准 C标准管：标准管浓度，0.5μmol/mL；V总：酶促反应总体积，0.25mL；V样：加入样本体积，0.1mL；V样总： 加入试剂一体积，1mL；T：反应时间，1/6小时；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌 或细胞总数，500万。 注意事项： 1. 由于每一个样都必须做对照，本试剂盒100管保证测48份Ca++Mg++-ATP酶。 2. 此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格无磷。避免磷污染是检测成败的关键。