SAINT-BIO/尚宝生物 BA1794 超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（邻苯三酚法比色法）

超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（邻苯三酚比色法） 产品货号：BA1794 产品规格：50T/100T 产品简介 超氧化物岐化酶(Superoxide Dismutase, SOD) 是含金属辅基的酶，能催化超氧化物阴离子发生岐化作用，生 成过氧化氢(H2O2) 和氧气(O2) ，是生物体内一种重要的抗氧化酶。由于超氧自由基是不稳定的自由基，寿命极 短，SOD活性一般用间接方法测定，并利用各种呈色反应来测定SOD活力，其中显色剂有NBT( 四氮唑蓝) 、 WST-1、WST-8等。 尚宝生物 超氧化物歧化酶(SOD) 检测试剂盒( 邻苯三酚比色法) 也叫邻/连苯三酚自氧化法或邻/连苯三酚 自氧化抑制法，其检测原理是邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出超氧阴离子自由基，进而生成黄色 的中间产物。在自氧化过程的初始阶段，黄色产物后的积累在滞后30~45s后与时间呈线性关系，黄色产物在325nm 处有强吸收。在有SOD存在时，由于SOD能催化超氧阴离子自由基与氢离子结合成氧气和过氧化氢，从而阻止了 中间产物的积累。因此可根据SOD抑制邻苯三酚自氧化能力测定SOD的酶活力。本试剂盒仅用于科研领域，不宜 用于临床诊断或其他用途。 产品内容： 试剂名称 50T 100T 保存条件 试剂(A): SOD Assay buffer 50ml 100ml 室温 试剂(B): 邻苯三酚显色液 4ml 7ml 4℃，避光 试剂(C): 空白对照液 1ml 1ml 室温 需自备的仪器和用品： 1. 蒸馏水、生理盐水或磷酸缓冲液 2. 离心机、离心管、小试管 3. 分光光度计、比色杯 4. 水浴锅或恒温箱 操作步骤（仅供参考）： 1. 准备样品： ① 血浆或含红细胞的样品：如果测定血浆中SDO活性，则从待测样品中分理出血清或血浆，不应有溶血，如果 含有红细胞应先4℃ 3000r/min 离心5min，转移上清至另一新的离心管中，适量生理盐水稀释后待测，如超过检 测范围，用磷酸缓冲液(pH7.8) 稀释后再测。如果需要测定红细胞中SOD活性，则应取一定体积的新鲜血液或肝 素抗凝血，混匀，3000r/min离心5min，弃上清，沉淀用ACK红细胞裂解液使其充分溶血，3000r/min离心5min， 上清液即为红细胞SOD粗提液。 ② 组织样品：动物用含有20U/ml Heparin的生理盐水(0.9% NaCl containing 20U/mlHeparin)灌流清除血液后获取组 织样品。按照每100mg组织加入500μl磷酸缓冲液(pH7.8) 的比例，用玻璃匀浆器在4℃或冰浴匀浆，4℃ 4000r/min 离心10min，取上清液(SOD粗提液) 用于酶活性的测定。 ③ 细胞样品：对于贴壁细胞，由于后续用于酶活性的测定，避免使用胰酶消化细胞。可以使用细胞刮或EDTA 处理细胞并收集细胞，细胞用无菌的PBS或生理盐水洗涤1次，按照每10细胞加入300-500μl磷酸缓冲液(pH7.8)的 比例，用玻璃匀浆器在4℃或冰浴匀浆，4℃ 10000r/min离心10min，取上清液(SOD粗提液) 用于酶活性的测定。 ④ 植物样品：准确称取植物材料( 果肉或者去叶脉的叶片)0.4g，剪碎，置于4℃预冷的研钵或匀浆器中，加入预 冷磷酸缓冲液(pH7.8) 1ml，低温研磨至匀浆后转移至离心管，用3ml 磷酸缓冲液冲洗研钵或匀浆器并转入离心管， 加总体积至4ml，4℃ 10000r/min离心20min，上清液为酶提取液，可用于SOD的检测。 ⑤ 澄清液体样品可取原液直接测定，浑浊液体样品可经4℃ 4000r/min离心15min，再取上清液测定。 ※ 注意：如果SOD酶活性较低，应相应减少提取液的总体积，以便提高SOD酶的浓度。 提取液建议使用磷酸缓冲液(50Mm pH7.8) ，也可以根据需要使用蒸馏水或其他溶液。 ⑥ 样品准备完毕后可以用BCA蛋白定量检测试剂盒测定蛋白浓度，通常10-20μg蛋白的细胞或组织匀浆液样品中 的SOD平均活力约1个活力单位左右( 不同细胞和组织的差异会比较大，该活力范围仅作为初步的参考) 。每种样 品准备20-100μg蛋白量通常已经足够用于后续检测。根据蛋白浓度和预计的蛋白使用量，用相关提取液适当稀释 样品。 例如小鼠肝脏组织10%匀浆液( 组织和匀浆液的重量比为10%) 上清，通常需要稀释10-100倍，准备好的样品如果 当天测定，可以冰浴保存；如果当天不能完成测定，可以-20℃冻存，但建议尽量当天完成测定。 2. 邻苯三酚自氧化速率测定：在25℃左右，于两个离心管中按下表依次加入各试剂。 加入物（ml） 自氧化空白管 自氧化测定管 SOD Assay buffer 0.94 0.94 蒸馏水 0.8 0.8 空白管 0.06 - 邻苯三酚显色液 - 0.06 加入显色液后立即混匀倾入1cm比色皿内，在325nm波长下测定0s、30s、60s、90s、120s 、150s 、180s两个 管的吸光值，计算线性范围内每分钟吸光度的增值( 自氧化测定管-自氧化空白管) ，即邻苯三酚的自氧化速率 ∆A325 (min -1 )本试剂盒经测定∆A325 (min -1 ) 约为0.060。可通过调节邻苯三酚的加入量控制自氧化速率再每分钟 0.060~0.07。 3. 样品SOD抑制邻苯三酚自氧化速率测定：按照下表依次加入相应成分，加入显色液后立即混匀倾入1cm比色 皿内，在325nm波长下测定两个管的吸光值，使抑制邻苯三酚自氧化的速率约为1/2邻苯三酚的自氧化速率， 即∆A´325 (min -1 )为0.030。 加入物（ml） 样品空白管 样品测定管 SOD Assay buffer 0.94 0.94 蒸馏水 0.72 0.72 样品提取液 0.08 0.08 空白对照管 0.06 - 邻苯三酚显色液 - 0.06 计算： SOD活力单位定义：25℃时，在1ml反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定义为1个活性 单位(U) ，即在325nm处为0.03OD/min为一个活力单位。若自氧化速率为35%~65%，通常可按比例计算，不在此 范围内的数值应增减样液用量。 抑制率=[∆A325 (min -1 ) －∆A´325 (min -1 )]/∆A325 (min -1 ) ×100% 液体样品中总SOD活力(U/ml) = 抑制率/50%×1.8×(1/V)×D 组织、细胞、植物等固体样品匀浆液中总SOD活力(U/g) = 抑制率/50%×1.8×(1/V) ×D×(V T /m) 血液中总SOD活力(U/ml) = 抑制率/50%×1.8×(1/V) ×D×(V T / V 0 ) 血液中总SOD活力(U/g·Hb) = 血液中总SOD活力(U/ml)/Hb(g·Hb /ml)×1000 式中：∆A325 (min -1 )= 邻苯三酚自氧化速率 ∆A´325 (min -1 )= 样品管抑制邻苯三酚自氧化速率 1.8= 反应液总体积(ml) V= 测定时样品所用体积(ml) D= 提取液稀释倍数 V T =SOD提取液总体积(ml) m= 样品质量(g) V 0 = 采血量(ml) Hb= 血红蛋白含量(g·Hb/ml) 注意事项： 1. 待测样品-70℃可保存1个月，需注意反复冻融会导致SOD部分失活。 2. 细胞或组织等样品制备时不易采用含有Triton X-100等去垢剂的溶液。 3. 抗氧化物会对本试剂盒的检测产生干扰，例如0.1mM ascorbic acid 、5mM GSH以及维生素C都会使测定出来 的吸光度显著升高，应设法除去或不添加相关成分。 4. 对于植物样品，研磨处理应迅速，以免SOD酶活下降，尽量在冰浴条件下处理样品。 5. 在邻苯三酚自氧化速率与酶活力测定过程中，记录时间应准确一致，以保证吸光度读数的准确性。 6. 反应温度、pH和邻苯三酚的浓度都对结果有影响，故应严格控制。 7. 所有实验器材必须清洁干燥。 8. SOD对邻苯三酚自氧化速率的抑制率在5min内呈线性。 9. 邻苯三酚自氧化速率以0.06为标准，可控制在0.06~0.07之间，可通过适当增减邻苯三酚的用量加以调节。 10. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 有效期：6个月有效。