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产品基本说明:
淀粉脱分支酶(starch debranching enzyme,DBE)能够专一、高效的裂解支链淀粉的α-1,6-糖苷键,对淀粉的 结构起“修饰”的作用,淀粉脱分支酶在调整支链淀粉侧链的链长方面起着关键作用,淀粉分支酶和淀粉脱分支酶 的平衡使得支链淀粉合成。 DBE催化支链淀粉产生还原糖,其与3,5-二硝基水杨酸反应生成棕红色物质,通过测定其在540nm下吸光值变 化可计算得DBE活性。 |
淀粉脱分支酶活性检测试剂盒(微量法)
产品货号:BA1922
产品规格:100管/48样
产品简介:
淀粉脱分支酶(starch debranching enzyme,DBE)能够专一、高效的裂解支链淀粉的α-1,6-糖苷键,对淀粉的 结构起“修饰”的作用,淀粉脱分支酶在调整支链淀粉侧链的链长方面起着关键作用,淀粉分支酶和淀粉脱分支酶 的平衡使得支链淀粉合成。
DBE催化支链淀粉产生还原糖,其与3,5-二硝基水杨酸反应生成棕红色物质,通过测定其在540nm下吸光值变 化可计算得DBE活性。
注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
产品组成:
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体100mL×1瓶 | 2-8℃ |
试剂一 | 液体8mL×1瓶 | 2-8℃ |
试剂二 | 粉剂×2支 | 2-8℃ |
试剂三 | 液体5mL×1瓶 | 2-8℃ |
试剂四 | 液体18mL×1瓶 | 2-8℃ |
标准品 | 粉剂×1支 | 2-8℃ |
溶液的配制:
1. 试剂二:临用前取1支加入1.5mL试剂一,充分溶解后待用,用不完的试剂2-8℃保存4周;
2. 标准品:10mg无水葡萄糖。临用前加入1mL蒸馏水溶解,配成10mg/mL葡萄糖溶液备用,2-8℃可保存两周;
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、台式低温离心机、水浴锅或恒温培养箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、 研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP管。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1. 组织:按照组织质量(g)︰提取液体积(mL)为1︰5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液)进行冰浴匀浆,然后15000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。
2. 细胞或细菌:按照细胞或细菌数量(104个)︰提取液体积(mL)为500~1000︰1的比例(建议500万个细胞或细菌加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞或细菌(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min); 然后15000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。
3. 液体:直接检测。(若溶液有浑浊则离心后取上清测定)
二、测定步骤
1. 分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至540nm,分光光度计蒸馏水调零。
2. 将10mg/mL标准液用蒸馏水稀释为1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1mg/mL的标准溶液备用。
序号 | 稀释前浓度(mg/mL) | 标准液体积(µL) | 蒸馏水体积(µL) | 稀释后浓度(mg/mL) |
1 | 10 | 100 | 900 | 1 |
2 | 1 | 160 | 40 | 0.8 |
3 | 1 | 120 | 80 | 0.6 |
4 | 1 | 80 | 120 | 0.4 |
5 | 1 | 40 | 160 | 0.2 |
6 | 1 | 20 | 180 | 0.1 |
实验中每个标准管需40µL标准溶液。
3. 取100μL样本沸水浴5min(盖紧,防止水分散失),冷却至室温后,8000g,常温离心5min,取上清备用。
4. 操作表 (在0.5mL或1.5mL离心管中) :
试剂名称(µL) | 对照管 | 测定管 | 标准管 | 空白管 |
煮沸样本 | 40 | - | - | - |
样本 | - | 40 | - | - |
标准溶液 | - | - | 40 | - |
蒸馏水 | - | - | - | 40 |
试剂一 | 40 | - | 40 | 40 |
试剂二 | - | 40 | - | - |
混匀,37℃水浴或恒温培养箱中准确反应2h | ||||
试剂三 | 40 | 40 | 40 | 40 |
试剂四 | 120 | 120 | 120 | 120 |
混匀,沸水浴5min(盖紧,防止水分散失),取出后立即冷却至室温,测定540nm处吸光值A,分 别记为A对照管,A测定管,A标准管,A空白管。计算ΔA=A测定管-A对照管,ΔA标准=A标准管-A空白管。每个测定管需设一个对照管(空白管和标准曲线只需检测1-2 次)。 |
注意:37℃水浴或恒温培养箱中反应2h后,离心管底部可能有沉淀,无需离心,直接进入下一步试验即可。
二、DBE活性计算
1. 标准曲线的绘制:
以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA带入方程得到x(mg/mL)。
2. DBE活性的计算:
(1)按蛋白浓度计算
酶活定义:每毫克蛋白每小时分解支链淀粉产生1mg葡萄糖为1个酶活力单位。
DBE酶活(U/mg prot)=x×V提取÷(V提取×Cpr)÷T=0.5x×Cpr
(2)按样本质量计算
酶活定义:每克样本每小时分解支链淀粉产生1mg葡萄糖为1个酶活力单位。
DBE酶活(U/g质量)=x×V提取÷W÷T=0.5x÷W
(3)按细胞或细菌数量计算
酶活定义:每104个细胞每小时分解支链淀粉产生1mg葡萄糖为1个酶活力单位。
DBE酶活(U/104cell)=x×V提取÷细胞数量(万个)÷T=0.5x÷细胞数量(万个)
(4)按液体体积计算
酶活定义:每mL样本每小时分解支链淀粉产生1mg葡萄糖为1个酶活力单位。
DBE酶活(U/mL)=x×V样÷V样÷T=0.5x
V提取:提取液体积,1mL;V样:加入的样本体积,0.04mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL,蛋白浓度自行 测定;W:样本质量,g;T:反应时间:2h。
注意事项:
1. A大于1.5时,建议将样本用提取液稀释后再进行测定。注意同步修改计算公式。
2. 建议每次实验沸水浴后冷却时间保持一致。
产品介绍: