SAINT-BIO/尚宝生物 BA1087 多聚半乳糖醛酸酶（PG）检测试剂盒（可见分光光度法）

多聚半乳糖醛酸酶（PG）检测试剂盒（可见分光光度法） 产品货号：BA1087 产品规格：50管/24样 产品简介： 多聚半乳糖醛酸酶（Ploygalacturonase, PG）属果胶酶的一种，广泛存在于植物、细菌及真菌中。其催化多聚 半乳糖醛酸分解，在果实软化、花粉授粉、种子发育成熟及器官脱落等方面具有重要作用，并且病原菌在侵染宿 主植物时，可分泌多聚半乳糖醛酸酶来降解宿主细胞壁，进而导致病程发展。 PG水解多聚半乳糖醛酸生成半乳糖醛酸，半乳糖醛酸与DNS试剂反应生成在540nm有特征吸收峰的棕红色物 质，测定540nm处吸光值变化可计算得果胶酶活性。 注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者 增加样本量进行检测。 产品内容： 试剂名称 规格 保存条件 提取液 液体30mL×1瓶 2-8℃ 试剂一 液体8mL×1瓶 2-8℃ 试剂二 粉剂×1瓶 2-8℃ 试剂三 液体20mL×1瓶 2-8℃ 标准品 粉剂×1支 2-8℃ 溶液的配制： 1. 试剂一：若溶液中有晶体析出，37℃水浴溶解； 2. 试剂二：临用前加入8mL蒸馏水，60℃水浴助溶； 3. 标准品：10mg半乳糖醛酸。临用前加入0.943mL蒸馏水，配成50μmol/mL的标准液。 需自备的仪器和用品： 可见分光光度计、低温台式离心机、水浴锅、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。 操作步骤： 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） 组织：按照质量（g）：蒸馏水体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液， 冰浴匀浆后于4℃，16000g，离心10min，取上清置于冰上待测。 细菌：先收集细菌到离心管内，离心后弃上清；按照细菌数量（10 4个）：提取液体积（mL）为500~100：1 的比例（建议500万个细菌加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细菌（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，总时 间5min）；然后4℃，16000g，离心10min取上清置于冰上待测。 液体：直接检测或用提取液稀释后检测。 二、测定步骤 1. 分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。 2. 将50μmol/mL标准液用蒸馏水稀释为10、6、4、3、2、1.5、1.2μmol/mL的标准溶液备用。 3. 操作表：(在1.5mL离心管中) 试剂名称（μL） 测定管 对照管 空白管 标准管 样本 50 50 - - 蒸馏水 - - 50 - 标准溶液 - - - 50 试剂一 100 100 100 100 试剂二 100 - 100 100 40℃水浴准确反应2h后，沸水浴加热10min（盖紧，防止水分散失），取出后冷却至室温。 - 试剂二 - 100 - - 试剂三 250 250 250 250 沸水浴加热5min（盖紧，防止水分散失），取出后冷却至室温。 蒸馏水 500 500 500 500 测定540nm处的吸光度，记为A测定管、A对照管、A空白管、A标准管，计算ΔA=A测定管-A对照管， ΔA标准=A标准管-A空白管。每个测定管需设一个对照管。 三、PG酶活计算 1. 标准曲线的绘制： 以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将ΔA带入方 程得到x（µmol/mL） 2. PG酶活的计算： （1）按样本蛋白浓度计算 酶活定义：在40℃，pH 6.0的条件下，每毫克蛋白每小时分解多聚半乳糖醛酸产生1μmol的半乳糖醛酸定义 为一个酶活力单位。 PG酶活（U/mg prot）=x×V提取÷（V提取×Cpr）÷T=0.5x÷Cpr （2）按样本质量计算 酶活定义：在40℃，pH 6.0的条件下，每克样本每小时分解多聚半乳糖醛酸产生1μmol的半乳糖醛酸定义为 一个酶活力单位。 PG酶活（U/g质量）=x×V提取÷W÷T=0.5x÷W （3）按照细菌数量计算 酶活定义：在40℃，pH 6.0的条件下，每10 4个细菌每小时分解多聚半乳糖醛酸产生1μmol的半乳糖醛酸定义 为一个酶活力单位。 PG酶活（U/10 4 cell）=x×V提取÷T÷细菌数量（万个）=0.5x÷细菌数量（万个） （4）按液体体积计算 酶活定义：在40℃，pH 6.0的条件下，每mL样本每小时分解多聚半乳糖醛酸产生1μmol的半乳糖醛酸定义为 一个酶活力单位。 PG酶活（U/mL）=x×V样÷V样÷T=0.5x V提取：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；V样：反应体系中样本体 积，0.05mL；T：酶促反应时间，2h。 注意事项： 1. 样本提取上清液置于冰上待测，且样本提取完成后建议当天提取当天内测完。 2. 当A大于2时，建议将样本用提取液稀释后再进行测定，并在计算公式中乘以相应稀释倍数。 3. 植物果实组织建议将样本稀释10倍或20倍后再测定。 4. 若样本ΔA值偏小，建议延长酶促反应时间，并在计算公式中除以相应时间。