SAINT-BIO/尚宝生物 BA1079 单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）活性检测试剂盒（紫外分光光度法）

单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）活性检测试剂盒

（紫外分光光度法）

注意：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

产品货号：BA1079

产品规格：50管/48样

产品简介：

MDHAR催化MDHA还原生成AsA，在抗坏血酸氧化还原代谢中具有重要作用。

MDHAR催化NADH还原MDHA生成AsA和NAD⁺，NADH在340 nm有特征吸收峰，但是NAD⁺没有。通过测定340 nm光吸收下降速率，来计算出MDHAR活性。

产品内容：

提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体40mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加入5 mL蒸馏水充分溶解。

试剂三：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加入5 mL蒸馏水充分溶解。

试剂四：液体×1瓶，-20℃避光保存。临用前加5mL试剂一充分溶解。

需自备的仪器和用品：

研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计、1mL石英比色皿、可调式移液枪和双蒸水。

操作步骤：

一、粗酶液提取：

1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）1：5-10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。10000rpm，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

2、细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500-1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声超声破碎细胞（功率300w，超声3s，间隔7s，总时间3min）；然后10000rpm，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

二、MDHAR测定操作： 

1. 分光光度计预热30 min，调节波长到340 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂一在25℃水浴锅中预热30 min。

3.依次在微量石英比色皿/96孔UV板中加入下列试剂

迅速混匀后于340nm比色，记录30s和150s的吸光值,分别记为A1、A2，ΔA=A1-A2，得到△A测定，△A空白。

三、MDHAR 活性计算：

（1）按蛋白浓度计算

MDHAR活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol NADH为为一个酶活单位。

MDHAR (U/mg prot) = [(△A测定-△A空白)÷(ε×d)×V反总×10⁶]÷（Cpr×V样）÷T

=0.804×(△A测定-△A空白)÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

MDHAR 活性单位定义：25℃中每克样品每分钟氧化1μmol NADH为1一个酶活单位。

MDHAR (U/g 鲜重) =[(△A测定-△A空白)÷(ε×d)×V反总×10⁶]÷(V样÷V样总×W)÷T

=0.804×(△A测定管-△A空白管) ÷W

(3)按细胞数量计算

MDHAR 活性单位定义：25℃中每10⁴个细胞每分钟氧化1μmol NADH为1一个酶活单位。

MDHAR (U/10⁴ cell) =[ (△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×10⁶]÷（细胞数量×V样÷V样总）÷T

=0.804×(△A测定管-△A空白管) ÷细胞数量

ε：NADH 摩尔消光系数，6220L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；10⁶：1mol=1×10⁶μmol；V反总：反应体系总体积，1mL=0.001L；V样：加入反应体系中上清液体积，100μL=0.1mL；V样总：提取液体积，1 mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本公司蛋白质含量BCA试剂盒；W ：样品质量，g；T：反应时间，2min；细胞数量：以 10⁴为单位计量，万个。