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产品基本说明：
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MDHAR催化MDHA还原生成AsA，在抗坏血酸氧化还原代谢中具有重要作用。 MDHAR催化NADH还原MDHA生成AsA和NAD+，NADH在340 nm有特征吸收峰，但是NAD+没有。通过测定340 nm光吸收下降速率，来计算出MDHAR活性。 |
单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）活性检测试剂盒（微量法）
注意：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。
产品货号：BA1080
产品规格：100管/96样
产品简介：
MDHAR催化MDHA还原生成AsA，在抗坏血酸氧化还原代谢中具有重要作用。
MDHAR催化NADH还原MDHA生成AsA和NAD+，NADH在340 nm有特征吸收峰，但是NAD+没有。通过测定340 nm光吸收下降速率，来计算出MDHAR活性。
产品内容：
提取液：液体110mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体15mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加入2 mL蒸馏水充分溶解。
试剂三：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加入2.5 mL蒸馏水充分溶解。
试剂四：液体×1瓶，-20℃避光保存。临用前加2mL试剂一充分溶解。
需自备的仪器和用品：
研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪和双蒸水
操作步骤：
一、粗酶液提取：
1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）1：5-10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。10000rpm，4℃离心10min，取上清置冰上待测。
2、细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500-1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声超声破碎细胞（功率300w，超声3s，间隔7s，总时间3min）；然后10000rpm，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
二、MDHAR测定操作：
1、分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到340 nm，蒸馏水调零。
2、试剂一在25℃水浴锅中预热30 min。
3、依次在微量石英比色皿/96孔UV板中加入下列试剂
试剂名称（μL） | 试剂二 | 试剂三 | 试剂四 | 试剂一 | 蒸馏水 | 上清液 |
空白管 | 20 | 20 | 20 | 120 | 20 | |
测定管 | 20 |
迅速混匀后于340nm比色，记录30s和150s的吸光值,分别记为A1、A2，ΔA=A1-A2，得到△A测定，△A空白。
三、MDHAR 活性计算：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按蛋白浓度计算
MDHAR活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol NADH为1U。
MDHAR (U/mg prot) = [(△A测定-△A空白)÷(ε×d)×V反总×106]÷（Cpr×V样）÷T
=0.804×(△A测定-△A空白)÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
MDHAR 活性单位定义：25℃中每克样品每分钟氧化1μmol NADH为1U。
MDHAR (U/g 鲜重) =[(△A测定-△A空白)÷(ε×d)×V反总×106]÷(V样÷V样总×W)÷T
=0.804×(△A测定管-△A空白管) ÷W
(3)按细胞数量计算
MDHAR 活性单位定义：25℃中每104个细胞每分钟氧化1μmol NADH为1U。
MDHAR (U/104 cell) =[ (△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷（细胞数量×V样÷V样总）÷T
=0.804×(△A测定管-△A空白管) ÷细胞数量
ε：NADH 摩尔消光系数，6220L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；106：1mol=1×106μmol；V反总：反应体系总体积，0.2mL=2×10-4L；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；V样总：提取液体积，1 mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本公司蛋白质含量BCA试剂盒；W ：样品质量，g；T：反应时间，2min；细胞数量：万个。
b.使用96孔板测定的计算公式如下：
（1）按蛋白浓度计算
MDHAR 活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol NADH为1U。
MDHAR (U/mg prot) = [(△A测定-△A空白)÷(ε×d)×V反总×106]÷（Cpr×V样）÷T
=1.340×(△A测定-△A空白) ÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
MDHAR 活性单位定义：25℃中每克样品每分钟氧化1μmol NADH为1U。
MDHAR (U/g 鲜重)=[(△A测定-△A空白)÷(ε×d)×V反总×106]÷(V样÷V样总×W)÷T
=1.340×(△A测定-△A空白) ÷W
(3)按细胞数量计算
MDHAR 活性单位定义：25℃中每104个细胞每分钟氧化1μmol NADH为1U。
MDHAR (U/104 cell) =[ (△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷（细胞数量×V样÷V样总）÷T
=1.340×(△A测定管-△A空白管) ÷细胞数量
ε：NADH 摩尔消光系数，6220 L/mol/cm；d：96孔板光径，0.6cm；106：1mol=1×106μmol；V反总：反应体系总体积，0.2mL=2×10-4L；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；V样总：提取液体积，1 mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本公司蛋白质含量BCA试剂盒；W ：样品质量，g；T：反应时间，2min；细胞数量：万个。
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