SAINT-BIO/尚宝生物 BA1857 单宁酶活性检测试剂盒（微量法）

单宁酶活性检测试剂盒（微量法）

产品货号：BA1857

产品规格：100T/48S

产品简介：

单宁酶全称是单宁酯酰水解酶(Tannase，EC 3.1.1.20)，存在于富含单宁的植物，也广泛存在于微生物中，可以水解酯键和缩酚羧键，生成没食子酸和葡萄糖。

使用没食子酸丙酯（PG）作为单宁酶酶促反应的底物，其在270nn下有特征吸收峰，根据其反应前后吸光度的变化来计算单宁酶活力。

 注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品组成：

溶液的配制：

1. 试剂一：临用前取1支加入1mL无水乙醇混匀溶解，用不完的试剂可以2-8℃保存一周；（1支粉剂溶解后可做100T，为了延长使用时间，此产品多给1支粉剂）

2. 标准品：5mg没食子酸丙酯。临用前加入1.178mL无水乙醇充分混匀溶解，配成20μmol/mL的标准溶液，2-8℃保存两周。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔UV板、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、超声破碎仪、 研钵/匀浆器、乙醇、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可参考文献）

1. 组织：称取约0.1g组织，加入1mL提取液，冰浴匀浆。10000rpm 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2. 细胞或细菌样本的制备：先收集细胞或细菌样本到离心管内，弃上清，按照每500万细胞或细菌加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）。10000rpm，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤 

1. 紫外分光光度计/酶标仪预热30min，波长调至270nm，紫外分光光度计蒸馏水调零。

2. 标准液的稀释：取5μL 20μmol/mL的标准溶液，加入1995μL提取液，充分混匀，配制成0.05μmol/mL标准液使用，现用现配。（实验中每管需要200μL，为减小实验误差，故配制大体积。）

3. 对照管样本处理：吸取0.02mL样本于1.5mLEP管中作为对照管，沸水浴5min，冷却至常温待测。

4. 加样表（在1.5mLEP管中分别加入）

三、单宁酶活性计算 

1. 按蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟减少1nmol PG的酶量定义为一个酶活性单位。

单宁酶（U/mg prot）=ΔA测定÷（A标准÷C标准）×1000×F×V酶促÷（V样本×Cpr）÷T

=1000×ΔA测定÷A标准÷Cpr

2. 按样本质量计算：

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟减少1nmol PG的酶量定义为一个酶活性单位。

单宁酶（U/g 质量）=ΔA测定÷（A标准÷C标准）×1000×F×V酶促÷（V样本×W÷V提取）÷T

=1000×ΔA测定÷A标准÷W

3. 按细胞或细菌数量计算：

单位的定义：每10⁴个细胞或细菌在反应体系中每分钟减少1nmol PG的酶量定义为一个酶活性单位。

单宁酶（U/10⁴cell）=ΔA测定÷（A标准÷C标准）×1000×F×V酶促÷（V样本×500÷V提取）÷T

=2×ΔA测定÷A标准

C标准：标准溶液的浓度，0.05μmol/mL；F：上清液的稀释倍数，上述反应体系中F=200μL÷10μL=20；1000：单位换算系数，1μmol=1000nmol；V样本：加入的样本体积，0.02mL；V酶促：酶促反应总体积，0.2mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；V提取：提取液体积，1mL；500：500万个细胞；T：反应时间，10min。

注意事项： 

如果A测定大于1.5，可以适当加大稀释倍数，保证总体积0.2mL不变，如5μL上清液和195μL提取液（相当于F=200/5=40），计算公式中需改变F和V上清液的数值。

实验实例： 

1. 取0.1g玉兰叶加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算ΔA测定=A对照管-A测定管=0.6631-0.6258=0.0373，按样本质量计算酶活得：

单宁酶（U/g质量）=1000×ΔA÷A标准÷W×F（稀释倍数）=1119U/g质量。