同商品型号列表:
产品基本说明:
本试剂盒适用于体外培养细胞的增值检测。贴壁细胞宜采用荧光检测方式,适用于荧光显微镜、 共聚焦显微镜、高内涵筛选仪检测。悬浮细胞可在孵育EdU后进行涂片,涂片后从固定开始跟贴壁细胞采用相同的染色检测流程。 |
EdU apollo 567in vitro kit EdU细胞增殖检测试剂盒(成像检测)
产品货号: BA1987
产品规格: 100T
产品简介:
EdU(5-Ethynyl-2’- deoxyuridine)是一种胸腺嘧啶核苷类似物,能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在复制的DNA分子中,通过基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应快速检测细胞DNA复制活性,可快速准确的检测细胞的增值能力。与BrdU检测方法相比,EdU检测方法更快速、更灵敏、更准确。EdU与T非常相似,而EdU染料只有BrdU抗体的1/500,在细胞内很容易扩散,无需DNA变性(酸解、热解、酶解等),可有效避免样品损伤,而且无需抗原抗体反应, 能在细胞和组织水平更准确地反映DNA复制活性。
本试剂盒适用于体外培养细胞的增值检测。贴壁细胞宜采用荧光检测方式,适用于荧光显微镜、 共聚焦显微镜、高内涵筛选仪检测。悬浮细胞可在孵育EdU后进行涂片,涂片后从固定开始跟贴壁细胞采用相同的染色检测流程。
产品组成:
产品名称 | 浓度 | 规格 |
EdU 溶液 (试剂A) | 1000× | 20μL |
Apollo反应缓冲液 (试剂B) | 20× | 500μL |
Apollo催化剂溶液 (试剂C) | 100× | 100μL |
Apollo荧光染料溶液 (试剂D) | 300× | 30μL |
Apollo缓冲添加剂 (试剂E) | 粉剂 | 100mg |
Hoechst 33342 (试剂F) | 100× | 150μL |
实验准备:
1. 1×PBS (pH 7.2~7.6)
2. 渗透剂(含0.5% Triton X-100的PBS)
3. 甘氨酸溶液(2mg/mL)(去离子水配置)
4. 细胞固定液(含4%多聚甲醛的PBS)
5. 96/24/12/6孔培养板或培养皿等
注意:请使用一次性手套,废液请妥善处理。
操作步骤(仅供参考):
荧光显微镜检测方法(以96孔板,A549贴壁细胞为例)
1、EdU标记
1.1 用细胞培养基按1000:1的比例稀释EdU溶液 (试剂A),制备适量50μM EdU培养基;
1)EdU浓度与孵育时间相关,短时间孵育(<2h)宜采用高浓度(10-50μM),长时间孵育(>24h)宜采用低浓度(1-10μM);
2)如果需配置10μM EdU培养基,需调整为5000:1稀释比例;
3)配置好的培养基建议现配现用。
1.2 每孔加入100μL 50μM EdU培养基孵育2小时,弃培养基;
1)Γ佳孵育时间与细胞周期相关(附表),大多数肿瘤细胞系均可采用2小时孵育时间;
2)EdU培养基用量以没过细胞为宜,但需要保证EdU孵育时间内的营养物质持续供给;
1.3 PBS清洗细胞1-2次,每次5分钟。
注:清洗目的是将未渗入DNA的EdU洗脱,清洗方式依据不同的细胞类型而定,贴壁不牢的细胞请降低清洗强度。
2、细胞固定化
2.1 每孔加入50μL细胞固定液 (即含4%多聚甲醛的PBS)室温孵育30分钟,弃固定液;
1)低浓度的多聚甲醛有利于细胞结构的保持,
2)可采用其他方式进行细胞固定。
2.2 每孔加入50μL 2mg/mL甘氨酸,脱色摇床孵育5分钟后,弃甘氨酸溶液;
注:目的是中和多聚甲醛,保证染色反应体系;
当采用其他方式进行细胞固定时可酌情省略此步骤;
2.3 每孔加入100μL PBS,脱色摇床清洗5分钟,弃PBS;
2.4 每孔加入100μL 渗透剂(0.5% TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10分钟;PBS清洗1次,5分钟。
注:当实验需要进行其他抗体染色时,或由于某些细胞类型对染料的吸附性较高,可能需要增强细胞膜通透性。
3、Apollo染色
3.1 每孔加入100μL的1×Apollo染色反应液,避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后,弃染色反应液;
1)染色液用量与细胞量相关,以覆盖细胞为宜;
2)孵育时间可以进行适当调整,调整范围为10-30分钟。
3.2 加入100μL渗透剂(0.5% TritonX-100的PBS) 脱色摇床清洗2-3次,每次10分钟,弃渗透剂;
3.3 (可选)每孔每次加入100μL甲醇清洗1-2次,每次5分钟;PBS清洗1次,每次5分钟。
注:由于某些细胞对染料的吸附性较高,需采用加强方式洗脱以降低染料背景。
4、DNA染色
4.1 用去离子水按100:1的比例稀释试剂F,制备适量1×Hoechst33342反应液,避光保存;
4.2 每孔加入100μL 1×Hoechst 33342反应液,避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后,弃染色反应液;
4.3 每孔每次加入100μL PBS清洗1-3次;
4.4 客户可选择进行其他染色步骤,否则每孔加入100μL PBS保存待用。
建议染色完成后立即进行观测;如果条件限制,请避光4℃湿润保存待测,但不应超过3天。若为细胞爬片或涂片,可使用抗荧光淬灭封片剂封片后4℃保存及进行检测。
实验参考:
表1 EdU孵育时间设定参考
细胞系 | 人胚胎细胞 | 酵母细胞 | 人成纤维细胞 | 人宫颈癌细胞 | 人胚肾细胞系 | 人神经细胞 |
细胞周期 | -30min | -3h | -18h | -21h | ~25h | -5d |
孵育时间 | 5min | 20min | 2h | 2h | 2h | 1d |
注:1)EdU孵育时间取决于细胞周期,一般为细胞周期的1/10至1/5,但大多数细胞系均可采用2h孵育时间;
2)考虑到细胞培养基、温度、湿度、光线等其他因素的影响,细胞周期会有所变化。
表2 EdU培养基及染色反应液的使用量参考
96孔板 | 48孔板 | 24孔板 | 12孔板 | 6孔板 | 5.5cm小皿 | |
EdU培养基 | 100μL | 200μL | 300μL | 500μL | 1mL | 2mL |
染色反应液 | 100μL | 200μL | 300μL | 500μL | 1mL | 2mL |
表3 Apollo染色反应液的配置参考(现用现配)
配制顺序 | Apollo染色反应液 | 500μL | 1mL | 5mL | 10mL |
1 | 去离子水 | 469μL | 938μL | 4.69mL | 9.38mL |
2 | Apollo反应缓冲液 (试剂B) | 25μL | 50μL | 250μL | 500μL |
3 | Apollo催化剂溶液 (试剂C) | 5μL | 10μL | 50μL | 100μL |
4 | Apollo荧光染料溶液 (试剂D) | 1.5μL | 3μL | 15μL | 30μL |
5 | Apollo缓冲添加剂 (试剂E) | 5mg | 9mg | 44mg | 88mg |
注:1)按顺序配制适量1× Apollo染色反应液,以免破坏正常的反应体系(现用现配,30分钟用完);
2)试剂E为白色粉末,较难准确称量,称量误差范围可稍微放宽,但不应超过±20%。且其较易氧化,使用后请旋紧管盖,如试剂出现棕黄色,则需报废或更换。
保存条件:室温运输,2-8℃储存,勿冻存,荧光试剂请避光保存,可稳定储存一年。
FAQ:
1. 什么样的信号才是真正的EdU阳性信号?
1)Apollo染色信号与核酸染色信号(Hoechst 33342或DAPI等核染信号)完全重合,或者与核重合的信号明显强于胞浆上的信号(染料附着等)
2)一般部分细胞上的信号呈现上述特征,而不是全部细胞。
2. 整个细胞都有EdU信号,或背景信号很强。
1)染色后洗涤不充分,可尝试加强洗涤解决。
2)染色过程中干片,导致染料粘附严重。
3)多聚甲醛固定时间过长而未使用甘氨酸中和。
4)没有阳性信号曝光过度导致背景严重。
3. 没有阳性信号。
1)EdU处理时间太短导致没有阳性信号。体外细胞实验一般EdU处理时间宜为细胞周期长度的1/5-1/10,阳性率约为20%-30%,体内实验需根据目的组织细胞的增值速度进行调整,若细胞增值速度慢,需要采用长时间的EdU处理时间,
2)对于阴性结果,可设置阳性对照(常见肿瘤细胞株如Hela EdU处理2小时或者EdU处理6小时以上的小鼠小肠上皮组织)以确认染色过程无误,对于目的样品,可使用较长的EdU处理时间以尽量先检测出信号,再根据具体信号比例进行EdU处理时间的调整。
3)染色过程干片,导致染料粘附严重
4. 细胞中表达GFP,Apollo染色后检测不到GFP的荧光信号。
Apollo染料会造成GFP的失活,故Apollo染色后无法直接检测GFP,建议可以使用GFP抗体进行复染医间接检测GFP。
产品介绍: