SAINT-BIO/尚宝生物 BA1091 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）活性检测试剂盒（紫外分光光度法）

二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）活性检测试剂盒 紫外分光光度法 产品货号：BA1091 产品规格：25管/24样 产品简介： 1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶（Rubisco, EC 4.1.1.39）是植物光合作用中的一个关键酶，既控制着CO2的固定， 同时又制约着碳素向Calvin循环和光呼吸循环分流，其活性的大小直接影响着光合速率。 在Rubisco的催化下，1分子的核酮糖-1,5-二磷酸（RuBP）与1分子的CO2结合，产生2分子的3-磷酸甘油酸 （PGA）；PGA可通过外加的3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用，产生甘油醛-3-磷酸，伴随着NADH 氧化生成NAD+；在340nm NADH有特征吸收峰，而NAD+没有此吸收峰，因此测定340nm吸光度下降速率可以代 表Rubisco的羧化酶活性。 注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或 者 增加样本量进行检测。 产品内容： 试剂名称 25T 保存条件 提取液 液体25mL×1瓶 2-8℃ 试剂一 液体25mL×1瓶 2-8℃ 试剂二 粉剂×1瓶 -20℃ 试剂三 粉剂×2支 -20℃ 试剂四 粉剂×1支 -20℃ 25T溶液的配制： 1. 试剂三：临用前取1支加入0.5mL蒸馏水充分溶解待用，振荡溶解后若出现浑浊可以离心使用； 2. 试剂四：临用前加入1mL蒸馏水充分溶解待用； 3. 工作液的配制：临用前在试剂二中加入全部试剂一，充分混匀，在25℃孵育5min。 需自备的仪器和用品： 紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。 操作步骤： 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） 1. 细菌或细胞样本的制备：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL提 取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次）；10000g 4℃离心10min，取上清, 置冰上待测。 2. 称取约0.1g组织加入1mL提取液，冰浴中匀浆。10000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。建议选取新 鲜的植物样本。 二、测定操作表： 1. 分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 2. 按下表步骤加样： 试剂名称 测定管 空白管 样本（μL） 100 - 蒸馏水（μL） - 100 试剂三（μL） 35 35 试剂四（μL） 35 35 工作液（μL） 900 900 记录340nm处20s时吸光值A1和5min20s时的吸光值A2，计算ΔA测定=A1测定-A2测定，ΔA空白=A1空白-A2 空白，ΔA =ΔA测定-ΔA空白。反应温度保持在25℃（空白管只做1-2管）。 三、Rubisco活性计算 1. 按样本蛋白浓度计算 单位的定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1 nmol NADH为一个酶活力单位。 Rubisco活力（U/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10 9]÷(Cpr×V样) ÷T =344×ΔA÷Cpr 2. 按样本质量计算 单位的定义：25℃中每g组织每分钟氧化1nmol NADH为一个酶活力单位。 Rubisco活力（U/g 质量）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10 9]÷(V样÷V样总×W) ÷T=344×ΔA÷W 3. 按细菌或细胞数量计算 单位的定义：25℃中每1万个细菌或细胞每分钟氧化1nmol NADH为一个酶活力单位。 Rubisco活力（U/10 4cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10 9]÷(V样÷V样总×500) ÷T=0.69×ΔA V反总：反应体系总体积，1.07×10 -3L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10 3L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm； V样：加入样本体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；W：样本质量，g；500： 细胞或细菌总数，500万；10 9：单位换算系数，1mol=10 9nmol。