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产品基本说明：
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辅酶I包括还原型和氧化型两种形式，在生物氧化中起传递氢的作用。氧化型辅酶I又称烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）是脱氢酶的辅酶，它在糖酵解、糖异生、三羧酸循环和呼吸链中发挥着不可替代的作用。中间产物 会将脱下的氢递给NAD，使之成为NADH（还原型辅酶I）。而NADH则会作为氢的载体，在呼吸链中通过化学渗透偶联的方式，合成ATP。NAD(H)在机体内有重要的生理意义，与物质代谢、能量代谢、抗细胞衰老、抗氧化以及一些疾病的发生密切相关。体内辅酶I含量降低会导致细胞损伤或衰亡。 分别用酸性和碱性提取液提取样品中NAD+和NADH，NADH通过PMS的递氢作用，还原氧化型噻唑蓝（MTT） 为甲瓒，在570nm下检测吸光值， NAD+可被乙醇脱氢酶还原为NADH，进一步采用MTT还原法检测。 |
辅酶ⅠNAD（H）含量检测试剂盒（可见分光光度法）
产品货号：BA1099
产品规格：50管/24样
产品简介：
辅酶I包括还原型和氧化型两种形式，在生物氧化中起传递氢的作用。氧化型辅酶I又称烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）是脱氢酶的辅酶，它在糖酵解、糖异生、三羧酸循环和呼吸链中发挥着不可替代的作用。中间产物 会将脱下的氢递给NAD，使之成为NADH（还原型辅酶I）。而NADH则会作为氢的载体，在呼吸链中通过化学渗透偶联的方式，合成ATP。NAD(H)在机体内有重要的生理意义，与物质代谢、能量代谢、抗细胞衰老、抗氧化以及一些疾病的发生密切相关。体内辅酶I含量降低会导致细胞损伤或衰亡。
分别用酸性和碱性提取液提取样品中NAD+和NADH，NADH通过PMS的递氢作用，还原氧化型噻唑蓝（MTT） 为甲瓒，在570nm下检测吸光值， NAD+可被乙醇脱氢酶还原为NADH，进一步采用MTT还原法检测。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者 增加样本量进行检测。
产品组成：
产品名称 | 规格 | 保存条件 |
酸性提取液 | 液体15mL×1瓶 | 2-8℃ |
碱性提取液 | 液体15mL×1瓶 | 2-8℃ |
试剂一 | 液体20mL×1瓶 | 2-8℃ |
试剂二 | 液体6mL×1瓶 | 2-8℃ |
试剂三 | 粉剂×1瓶 | -20℃ |
试剂四 | 粉剂×1瓶 | 2-8℃ |
试剂五 | 液体3mL×1瓶 | -20℃ |
试剂六 | 液体40mL×1瓶 | 2-8℃ |
试剂七 | 液体5mL×1瓶（自备） | 室温 |
NAD标准品 | 粉剂×1支 | -20℃ |
NADH标准品 | 粉剂×1支 | -20℃ |
溶液的配制：
1. 试剂三：临用前加入6.1mL蒸馏水充分溶解，4℃保存一周；
2. 试剂四：临用前加入6.6mL蒸馏水充分溶解，4℃保存一周；
3. 试剂七：72mL乙醇和3mL蒸馏水混合，备用；
4. NAD标准品：临用前加入1.5mL蒸馏水，即2µmol/mL，将其稀释为1.25nmol/mL的NAD标准溶液备用；
5. NADH标准品：临用前加入1.4mL蒸馏水，即2µmol/mL，将其稀释为1.25nmol/mL的NADH标准溶液备用。
自备材料：
可见分光光度计、台式离心机、移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤 (仅供参考) ：
一、NAD+和NADH的提取（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1. 血清（浆）中NAD+和NADH的提取：
NAD+的提取：取0.1mL血清（浆），加入0.5mL酸性提取液，煮沸5min (盖紧，以防止水分散失)，冰浴冷却后，10000g 4℃离心10min；取上清200µL，加入等体积碱性提取液；混匀，10000g 4℃离心10min，取上清，冰上保存待测。
NADH的提取：取0.1mL血清（浆），加入0.5mL碱性提取液，煮沸5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴冷却后，10000g 4℃离心10min，取上清200µL，加入等体积酸性提取液；混匀，10000g 4℃离心10min，取上清, 冰上保存待测。
2. 组织中NAD+和NADH的提取：
NAD+的提取：称取约0.1g组织，加入0.5mL酸性提取液，冰浴研磨，煮沸5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴冷却后，10000g 4℃离心10min，取上清200µL，加入等体积碱性提取液混匀，10000g 4℃离心10min，取上清，冰上保存待测。
NADH的提取：称取约0.1g组织，加入0.5mL碱性提取液，冰浴研磨，煮沸5min(盖紧，以防止水分散失)， 冰浴冷却后，10000g 4℃离心10min，取上清200µL，加入等体积酸性提取液混匀，10000g 4℃离心10min，取上清，冰上保存待测。
3. 细胞或细菌中NAD+和NADH的提取：
NAD+的提取：收集500万细胞或细菌，加入0.5mL酸性提取液，超声波破碎1min（强度20％或200W，超声2s，停1s），煮沸5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min，取上清液200uL至另一新的离心管中，加入等体积的碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心10min，取上清，冰上保存待测。
NADH的提取：收集500万细胞或细菌，加入0.5mL碱性提取液，超声波破碎1min（强度20％或200W，超声2s，停1s），煮沸5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min，取上清液200uL至另一新的离心管中，加入等体积的酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心10min，取上清，冰上保存待测。
二、测定步骤
1. 分光光度计预热30分钟以上，调节波长至570nm，蒸馏水调零。
2. 操作表（在1.5mL棕色EP管中按下表依次加样）
试剂名称 | 对照管(µL) | 测定管(µL) | NAD或NADH标准管(µL） | 空白管(µL) |
上清液 | 50 | 50 | - | - |
标准溶液 | - | - | 50 | - |
蒸馏水 | - | - | - | 50 |
试剂六 | 500 | - | - | - |
试剂一 | 250 | 250 | 250 | 250 |
试剂二 | 75 | 75 | 75 | 75 |
试剂三 | 75 | 75 | 75 | 75 |
试剂四 | 75 | 75 | 75 | 75 |
试剂五 | 35 | 35 | 35 | 35 |
充分混匀，室温避光静置20min | ||||
试剂六 | - | 500 | 500 | 500 |
充分混匀，静置5min后，15000rpm，25℃离心15min，弃上清，沉淀中加入： | ||||
试剂七 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 |
混匀，570nm下比色，读取吸光值ΔA测定=A测定管-A对照管，NAD标准管的记为ΔA标准1=A标准管1-A空白管。NADH标准管的记为ΔA标准2=A标准管2-A空白管。（空白管只需做1-2次）
三、NAD+含量的计算
1. 血清（浆）中NAD+含量计算
NAD+含量(nmol/mL）=ΔA测定÷（ΔA标准1÷C标）×V提取÷V血清=12.5×ΔA测定÷ΔA标准1
2. 组织、细菌、细胞中NAD+含量计算
(1) 按样本蛋白浓度计算
NAD+ (nmol/mg prot）=ΔA测定÷（ΔA标准1÷C标）×V提取÷(V提取×Cpr)= 1.25×ΔA测定÷ΔA标准1 ÷ Cpr
(2) 按样本质量计算
NAD+ (nmol/g 质量）=ΔA测定÷（ΔA标准1÷C标）×V提取÷W= 1.25×ΔA测定÷ΔA标准1÷W
(3) 按细菌或细胞数量计算
NAD+ (nmol/104cell）=ΔA测定÷（ΔA标准1÷C标）×V提取÷500=0.0025×ΔA测定÷ΔA标准1
四、NADH含量的计算
1. 血清（浆）中NADH含量计算
NADH含量(nmol/mL）=ΔA测定÷（ΔA标准2÷C标）×V提取÷V血清=12.5×ΔA测定÷ΔA标准2
2. 组织中NADH含量计算
(1) 按样本蛋白浓度计算
NADH (nmol/mg prot）=ΔA测定÷（ΔA标准2÷C标）×V提取÷(V样品×Cpr)=1.25×ΔA测定÷ΔA标准2÷ Cpr
(2) 按样本质量计算
NADH (nmol/g 质量）=ΔA测定÷（ΔA标准2÷C标）×V提取÷W=1.25×ΔA测定÷ΔA标准2÷W
(3) 按细菌或细胞数量计算
NADH (nmol/104cell）=ΔA测定÷（ΔA标准2÷C标）×V提取÷500=0.0025×ΔA测定÷ΔA标准2
C标：NAD或NADH标准溶液的浓度，1.25nmol/mL；Cpr:蛋白浓度，mg/mL；V提取：加入提取液总体积，1mL；V血清：提取时加入的血清体积，0.1mL；W：样本质量，g；500：500万个细胞。
注意事项：
1. 操作过程应避光。不可将试剂一、二、三和四混合后再加，必须分开加。
2. 反应过程要注意避光。
3. 当吸光值大于1时，建议稀释后测量，计算公式中应当乘以稀释倍数。
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