SAINT-BIO/尚宝生物 BA1100 辅酶ⅠNAD（H）含量检测试剂盒（微量法）

辅酶ⅠNAD(H)含量检测试剂盒（微量法）

注意：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

产品货号：BA1100

产品规格：100管/48样

产品简介：

辅酶I包括还原型和氧化型两种形式，在生物氧化中起传递氢的作用。氧化型辅酶I又称烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）是脱氢酶的辅酶，它在糖酵解，糖异生，三羧酸循环和呼吸链中发挥着不可替代的作用。中间产物会将脱下的氢递给NAD，使之成为NADH（还原型辅酶 I）。而NADH则会作为氢的载体，在呼吸链中通过化学渗透偶联的方式，合成ATP。NAD(H)在机体内有重要的生理意义，与物质代谢、能量代谢、抗细胞衰老、抗氧化以及一些疾病的发生密切相关。体内辅酶I含量降低会导致细胞损伤或衰亡。

分别用酸性和碱性提取液提取样品中NAD⁺和NADH，NADH通过PMS的递氢作用，还原氧化型噻唑蓝（MTT）为甲瓒，在570 nm下检测吸光值，而NAD⁺可被乙醇脱氢酶还原为NADH，进一步采用MTT还原法检测。

产品内容：

酸性提取液：液体25mL×1瓶，4℃保存；

碱性提取液：液体25mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体5mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：液体1.5mL×1支，4℃保存

试剂三：粉剂×1支，-20℃保存，用时加入1.6mL双蒸水，混匀，4℃保存一周；

试剂四：粉剂×1支，4 ℃保存，用时加入1.9mL双蒸水，混匀，4℃保存一周；

试剂五：液体0.7mL×1支，4 ℃保存；

试剂六：液体15mL×1瓶，4 ℃保存；

试剂七：自备。19.2mL乙醇和0.8mL 蒸馏水充分混合备用。

NAD⁺标准品：粉剂×1瓶，-20℃保存。临用前加入3mL蒸馏水，即1umol/mL，将其稀释为1.25nmol/mL的NAD 标准溶液备用。

NADH标准品：粉剂×1瓶，-20℃保存。临用前加入2.8mL蒸馏水，即1umol/mL，将其稀释为1.25nmol/mL的 NAD 标准溶液备用。

需自备的仪器和用品：

酶标仪、台式离心机、移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、NAD⁺和NADH的提取： 

1、血清（浆）中NAD⁺和NADH的提取：

NAD⁺的提取：取0.1mL血清（浆），加入0.5mL酸性提取液，煮沸5min (盖紧，以防止水分散失)，冰浴冷却后，10000g 4℃离心10min；取上清200uL，加入等体积碱性提取液；混匀，10000g4℃离心10min，取上清，冰上保存待测。

NADH的提取：取0.1mL血清（浆），加入0.5mL碱性提取液，煮沸5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴中冷却后，10000g 4℃离心10min，取上清200uL，加入等体积酸性提取液；混匀，10000g4℃离心10min，取上清,冰上保存待测。

2、组织中NAD⁺和NADH的提取：

NAD⁺的提取：称取约0.1g组织，加入0.5mL酸性提取液，冰浴研磨，煮沸5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴冷却后，10000g 4℃离心10min，取上清200uL，加入等体积碱性提取液混匀，10000g 4℃离心10min，取上清,冰上保存待测。

NADH的提取：称取约0.1g组织，加入0.5mL碱性提取液，冰浴研磨，煮沸5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴冷却后，10000g 4℃离心10min，取上清200uL，加入等体积酸性提取液混匀，10000g 4℃离心10min，取上清,冰上保存待测。

3、细胞或细菌中NAD⁺和NADH的提取：

NAD⁺的提取：收集500万细胞或细菌，加入0.5mL酸性提取液，超声波破碎1min（强度20％或200W，超声2s，停1s），煮沸5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min，取上清液200uL至另一新的离心管中，加入等体积的碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心10min，取上清,冰上保存待测。

NADH的提取：收集500万细胞或细菌，加入0.5mL碱性提取液，超声波破碎1min（强度20％或200W，超声2s，停1s），煮沸5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min，取上清液200uL至另一新的离心管中，加入等体积的酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃离心10min，取上清,冰上保存待测。

二、测定步骤：

1、 酶标仪调节波长至570nm，蒸馏水调零。

2、 操作表（在1.5ml棕色EP管中按下表依次加样）

NAD⁺含量的计算

1、血清（浆）中NAD⁺含量计算

NAD⁺含量(nmol/mL）=∆A测定÷（∆A标准1÷C标）×V提取÷V血清=12.5×∆A测定÷∆A标准1

2、组织、细菌、细胞中NAD+含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NAD⁺ (nmol/mg prot）=∆A测定÷（∆A标准1÷C标）×V提取÷(V提取×Cpr)= 1.25×∆A测定÷∆A标准1

(2)按样本鲜重计算

NAD⁺ (nmol/g 鲜重）=∆A测定÷（∆A标准1÷C标）×V提取÷W= 1.25×∆A测定÷∆A标准1÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

NAD⁺ (nmol/10⁴cell）=∆A测定÷（∆A标准1÷C标）×V提取÷500=0.0025×∆A测定÷∆A标准1

NADH含量的计算

1、血清（浆）中NADH含量计算

NADH含量(nmol/mL）=∆A测定÷（∆A标准2÷C标）×V提取÷V血清==12.5×∆A测定÷∆A标准2

2、组织中NADH含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NADH (nmol/mg prot）=∆A测定÷（∆A标准2÷C标）×V提取÷(V样品×Cpr)= 1.25×∆A测定÷∆A标准2

(2)按样本鲜重计算

NADH (nmol/g 鲜重）=∆A测定÷（∆A标准2÷C标）×V提取÷W=1.25×∆A测定÷∆A标准2÷W

(3)按细菌或细胞密度计·算

NADH (nmol/10⁴cell）=∆A测定÷（∆A标准2÷C标）×V提取÷500=0.0025×∆A测定÷∆A标准2

C标：NAD或NADH标准溶液的浓度，1.25nmol/mL；V提取：加入提取液总体积，1mL；V血清：提取时加入的血清体积，0.1mL；W：样本鲜重，g；500:500万个细胞。 

注意事项： 

1、操作过程应避光。不可将试剂一、二、三和四混合后再加，必须分开加。

2、当吸光值大于1时，建议稀释后测量。