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产品基本说明：
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ProDH是存在于线粒体内的催化脯氨酸降解的关键酶。降低ProDH活性对于调节渗透平衡、防止渗透胁迫对 植物造成伤害、清除自由基、保护细胞结构具有重要意义。 ProDH催化脯氨酸脱氢生成延丙酮酸，脱下的氢通过吩嗪二甲酯硫酸（PMS）传递还原2,6-二氯酚靛酚 （DCPIP），并且在600nm处具有特征吸收峰，通过600nm吸光度的下降，测定2,6-DCPIP的还原速度，代表ProDH活性。 |
脯氨酸脱氢酶（ProDH）活性检测试剂盒（微量法）
产品货号：BA1094
产品规格：100管/96样
产品简介：
ProDH是存在于线粒体内的催化脯氨酸降解的关键酶。降低ProDH活性对于调节渗透平衡、防止渗透胁迫对 植物造成伤害、清除自由基、保护细胞结构具有重要意义。
ProDH催化脯氨酸脱氢生成延丙酮酸，脱下的氢通过吩嗪二甲酯硫酸（PMS）传递还原2,6-二氯酚靛酚 （DCPIP），并且在600nm处具有特征吸收峰，通过600nm吸光度的下降，测定2,6-DCPIP的还原速度，代表ProDH活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者 增加样本量进行检测。
试验中所需的仪器和试剂:
天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、丙酮、匀浆器/研钵、冰、蒸馏水。
产品组成：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液一 | 液体100mL×1瓶 | 2-8℃ |
提取液二 | 液体1.2mL×1支 | 2-8℃ |
试剂一 | 液体20mL×1瓶 | 2-8℃ |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | 2-8℃ |
试剂三 | 粉剂×1瓶 | 2-8℃ |
标准品 | 粉剂×1瓶 | -20℃ |
溶液的配制：
1. 试剂二：临用前加入2.5mL蒸馏水充分溶解待用，用不完的试剂4℃保存；
2. 试剂三：临用前加入4mL蒸馏水充分溶解待用，用不完的试剂4℃保存；
3. 试剂四：临用前加入5mL蒸馏水充分溶解待用，用不完的试剂可分装-20℃保存，避免反复冻融。
4. 工作液的配制：首先将试剂三和试剂四配成溶液，临用前根据用量按照试剂一（V）：试剂二（V）：试 剂三（V）=1.6（mL）：0.2（mL）：0.15（mL）的比例充分混匀。（注意：现配现用，用多少配多少）
操作步骤 (仅供参考) ：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1. 组织：按照组织质量（g）：提取液一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液一），进行冰浴匀浆，1500g 4℃离心15min，取上清液于一支新的EP管中，加入10μL提取液二，涡旋混匀，冰浴放置30min后，15000g 4℃离心20min，取上清置冰上待测。
2. 细胞或细菌：按照细胞数量（104个）：提取液一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL 提取液一），冰浴匀浆，1500g 4℃离心15min，取上清液于一支新的EP管中，加入10μL提取液二，涡旋混匀，冰浴放置30min后，15000g 4℃离心20min，取上清置冰上待测。
二、测定步骤
1. 分光光度计/酶标仪预热30min以上，波长调至600nm，分光光度计蒸馏水调零。
2. 工作液置于37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）水浴5min。
3. 加样表（在微量玻璃比色皿/96孔板中分别加入下列试剂）
试剂名称（μL） | 测定管 | 空白管 |
工作液 | 160 | 160 |
试剂四 | 20 | 20 |
样本 | 20 | - |
蒸馏水 | - | 20 |
在微量玻璃比色皿/96孔板中分别加入上述试剂，充分混匀后于600nm处测定10s时的吸光值，迅速置于37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）水浴3min，拿出迅速擦干测定190s时的吸光值（有控温功能的酶标 仪可以将温度设置为25℃或者37℃），空白管10s和190s的吸光度分别记为A1、A2，测定管10s和190s的吸 光度记为A3、A4。计算△A测定=A3-A4，ΔA空白=A1-A2，ΔA=ΔA测定-ΔA空白（空白管只需做1-2次）。 | ||
二、ProDH酶活计算
A、按微量玻璃比色皿计算
1. 按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每分钟每mg组织蛋白在每mL反应体系中使600nm处吸光值变化0.01为一个酶活力单位。
ProDH（U/mg prot）=ΔA÷0.01×V反总÷（V样×Cpr）÷T =333.33×ΔA÷Cpr
2. 按样本质量计算：
单位定义：每分钟每g组织在每mL反应体系中使600nm处吸光值变化0.01为一个酶活力单位。
ProDH（U/g 质量）=ΔA÷0.01×V反总÷(W× V样÷V样总)÷T =333.33×ΔA÷W
3. 按细胞数量计算：
单位定义：每分钟每1万个细胞在每mL反应体系中使600nm处吸光值变化0.01为一个酶活力单位。
ProDH（U/104cell）=ΔA÷0.01×V反总÷(500×V样÷V样总)÷T =0.67×ΔA
V反总：反应体系总体积，0.2mL；V样：加入样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，3min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：500万个细胞。
B、按96孔板计算
1. 按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每分钟每mg组织蛋白在每mL反应体系中使600nm处吸光值变化0.005为一个酶活力单位。
ProDH（U/mg prot）=ΔA÷0.005×V反总÷（V样×Cpr）÷T =666.67×ΔA÷Cpr
2. 按样本质量计算：
单位定义：每分钟每g组织在每mL反应体系中使600nm处吸光值变化0.005为一个酶活力单位。
ProDH（U/g 质量）=ΔA÷0.005×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T =666.67×ΔA÷W
3. 按细胞数量计算：
单位定义：每分钟每1万个细胞在每mL反应体系中使600nm处吸光值变化0.005为一个酶活力单位。
ProDH（U/104cell）=ΔA÷0.005×V反总÷(500×V样÷V样总)÷T =1.33×ΔA
V反总：反应体系总体积，0.2mL；V样：加入样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，3min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：500万个细胞。
注意事项：
1. ΔA大于0.6时或者A3大于1.5时建议将样本上清用蒸馏水稀释后再进行测定。
2. 控制A3在0.8以上（96孔板在0.4以上），若A3小于0.8（用96孔板数值小于0.4时），建议将样本上清用蒸馏水稀释后再进行测定。
3. 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过0.02。
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