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产品基本说明：
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辅酶ⅡNADP(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NADP+和NADPH含量测定可以计算NADP（NADPH + NADP+ )含量和NADPH/NADP+比值，其变化与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。NADPH/NADP+比值不仅是细胞氧化还原态的主要标志之一，而且在PPP途径、生物合成和抗氧化代谢中具有重要调控作用。 分别用酸性和碱性提取液提取样品中NADP+和NADPH。NADPH通过PMS的递氢作用，使氧化型噻唑蓝（MTT）还原为甲瓒，570nm下检测吸光值，从而测定NADPH含量。利用6-磷酸葡萄 糖脱氢酶还原NADP+为 NADPH，从而检测NADP+含量。 |
辅酶ⅡNADP（H）含量检测试剂盒（可见分光光度法）
产品货号：BA1097
产品规格：50管/24样
产品简介：
辅酶ⅡNADP(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NADP+和NADPH含量测定可以计算NADP（NADPH + NADP+ )含量和NADPH/NADP+比值，其变化与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。NADPH/NADP+比值不仅是细胞氧化还原态的主要标志之一，而且在PPP途径、生物合成和抗氧化代谢中具有重要调控作用。
分别用酸性和碱性提取液提取样品中NADP+和NADPH。NADPH通过PMS的递氢作用，使氧化型噻唑蓝（MTT）还原为甲瓒，570nm下检测吸光值，从而测定NADPH含量。利用6-磷酸葡萄 糖脱氢酶还原NADP+为 NADPH，从而检测NADP+含量。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者 增加样本量进行检测。
产品内容：
酸性提取液：50mL×1瓶，4℃保存；
碱性提取液：50mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：基质缓冲液15mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1支，-20℃保存，用时加入4mL双蒸水，混匀；
试剂三：粉剂×1支，-20℃保存，用时加入4mL双蒸水，混匀；
试剂四：粉剂×1支，4 ℃保存，用时加入4mL双蒸水，混匀；
试剂五：液体1.8mL×1支，4 ℃保存；
试剂六：液体30mL×1瓶，4 ℃保存；
试剂七：液体50mL×1瓶，4 ℃保存。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿或酶标仪、研钵、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、NADP和NADPH的提取：
1. 血清（浆）中NADP和NADPH的提取：
NADP的提取：取0.1mL血清（浆），加入0.9mL酸性提取液，煮沸5min（盖紧）；冰浴冷却后，10000g，4℃离心10min；取上清液，加入等体积碱性提取液使之中和；混匀， 10000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
NADPH的提取：取0.1mL血清（浆），加入0.9mL碱性提取液，煮沸5min（盖紧）；冰浴冷却后，10000g 4℃离心10min；取上清液，加入等体积酸性提取液使之中和；混匀，10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2. 组织中NADP和NADPH的提取：
NADP的提取：称取约0.1g组织，加入0.9mL酸性提取液，冰浴研磨，煮沸5min（盖紧）；冰浴冷却后，10000g，4℃离心10min；取上清液加入等体积碱性提取液混匀， 10000g，4℃离心10min，取上清，冰上保存待测。
NADPH的提取：称取约0.1g组织，加入0.9mL碱性提取液，冰浴研磨，煮沸5min（盖紧）；冰浴冷却后，10000g 4℃离心10min；取上清液加入等体积酸性提取液混匀，10000g 4℃离心10min，取上清，冰上保存待测。
3. 细胞或细菌中NADP+和NADPH的提取：
NADP的提取：收集400-500万细胞或细菌，加入0.9mL酸性提取液，超声波破碎1min（强度20％或200W， 超声2s，停1s），煮沸5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min，取上清液至另一新的离心管中，加入等体积的碱性提取液使之中和，混匀，冰上保存待测。
NADH的提取：收集400-500万细胞或细菌，加入0.9mL碱性提取液，超声波破碎1min（强度20％或200W，超声2s，停1s），煮沸5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心10min，取上清液至另一新的离心管中，加入等体积的酸性提取液使之中和，混匀，冰上保存待测。
二、测定步骤(在1.5mL EP管中按下表依次加样）：
试剂名称 | 测定孔（μL） |
样本 | 50 |
双蒸水 | |
试剂一 | 250 |
试剂二 | 75 |
试剂三 | 75 |
试剂四 | 75 |
试剂五 | 35 |
对照管可以只做一个，不需每一个样品都做对照。充分混匀后，室温避光静置40min。 | |
试剂六 | 500 |
充分混匀，静置5min后，20000g，4℃离心5min，弃上清，沉淀中加入： | |
试剂七 | 1000 |
混匀，570nm下比色。
（一）NADP+含量的计算
1. 血清（浆）中NADP +含量计算
NADP +含量(µmol/mL）=（测定管OD值-0.047）×376
2. 组织中NADP+含量计算
(1) 按样本蛋白浓度计算
NADP + (µmol/g prot）= (测定管OD值-0.047)×37.6 ÷样本蛋白浓度（g/L）
(2) 按样本鲜重计算
NADP + (µmol/g mass）= (测定管OD值-0.047)×37.6 ÷样本鲜重（g/L）
3. 细菌或细胞中NADP+含量计算
(1) 按样本蛋白浓度计算
NADP+ (µmol/g prot）= (测定管OD值-0.047)×37.6 ÷样本蛋白浓度（g/L）
(2) 按细菌或细胞密度计算
NADP+ (µmol/104 cell）= (测定管OD值-0.047)×37.6 ÷细菌或细胞（104 cell/L）
（二）NADPH含量的计算
1. 血清（浆）中NADPH含量计算
NADPH含量(µmol/L）= (测定管OD值-0.047)×855
2. 组织中NADPH含量计算
(1) 按样本蛋白浓度计算
NADPH (µmol/g prot）= (测定管OD值-0.047)×85.5 ÷样本蛋白浓度（g/L）
(2) 按样本鲜重计算
NADPH (µmol/g mass）= (测定管OD值-0.047)×85.5 ÷样本鲜重（g/L）
3. 细胞或细菌中NADPH含量计算
(1) 按样本蛋白浓度计算
NADPH（µmol/g prot）= (测定管OD值-0.047)×85.5 ÷样本蛋白浓度（g/L）
(2)按细菌或细胞密度计算
NADPH (µmol/104cell）= (测定管OD值-0.047)×85.5 ÷细菌或细胞密度（104cell/L）
注意事项：
1. 若用比色皿测，沉淀用试剂七溶解后必须立即测。Γ好加一个测一个。
2. 若用酶标板测，也必须在测定时再加试剂七，加入1000μL试剂七溶解沉淀，混匀后，取300μL至酶标板中，立即测定。
3. 不可将试剂一、二、三和四混合后再加，必须分开加。
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