SAINT-BIO/尚宝生物 BA1098 辅酶ⅡNADP（H）含量检测试剂盒（微量法）

辅酶ⅡNADP（H）含量检测试剂盒（微量法）

产品货号：BA1098

产品规格：100管/48样

产品简介：

辅酶ⅡNADP(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NADP+和NADPH含量测定可以计算NADP（NADPH + NADP⁺ )含量和NADPH/NADP⁺比值，其变化与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。NADPH/NADP⁺比值不仅是细胞氧化还原态的主要标志之一，而且在PPP途径、生物合成和抗氧化代谢中具有重要调控作用。

分别用酸性和碱性提取液提取样品中NADP⁺和NADPH。NADPH通过PMS的递氢作用，使氧化型噻唑蓝（MTT）还原为甲瓒，570nm下检测吸光值，从而测定NADPH含量。利用6-磷酸葡萄 糖脱氢酶还原NADP⁺为 NADPH，从而检测NADP⁺含量。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者 增加样本量进行检测。

产品内容：

酸性提取液：50mL×1瓶，4℃保存；

碱性提取液：50mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体10mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1支，-20℃保存，用时加入3mL蒸馏水，混匀；溶解后4℃保存一周；

试剂三：粉剂×1支，-20℃避光保存，用时加入3mL蒸馏水，混匀；溶解后4℃保存一周；

试剂四：粉剂×1支，4℃避光保存，用时加入3mL蒸馏水，混匀；溶解后4℃保存一周；

试剂五：液体3.6 mL×1支，4℃保存；

试剂六：液体30mL×1瓶，4 ℃保存；

试剂七：液体50mL×1瓶，4 ℃保存。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和 蒸馏水。

操作步骤：

一、NADP⁺和NADPH的提取：

1. 血清（浆）中NADP和NADPH的提取：

NADP⁺的提取：取血清（浆）体积（mL）：酸性提取液体积（mL）为1：5-10的比例（建议取约0.1mL血清（浆），加入1mL酸性提取液），95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴冷却后，10000g，4℃离心10min；取500µL上清液，加入500µL碱性提取液使之中和；混匀， 10000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

NADPH的提取：取血清（浆）体积（mL）：碱性提取液体积（mL）为1：5-10的比例（建议取约0.1mL血清（浆），加入1mL碱性提取液），95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴冷却后，10000g 4℃离心10min；取500µL上清液，加入500µL酸性提取液使之中和；混匀，10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2. 组织中NADP⁺和NADPH的提取：

NADP⁺的提取：按照组织质量（g），酸性提取液体积（mL）为1：5-10的比例（建议取约0.1mL血清（浆），加入1mL酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）冰浴中冷却后，10000g 4℃离心10min，取500µL上清液，加入500µL碱性提取液使之中和；混匀，10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

NADPH的提取：按照组织质量（g），碱性提取液体积（mL）为1：5-10的比例（建议取约0.1mL血清（浆），加入1mL碱性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）冰浴中冷却后，10000g 4℃离心10min，取500µL上清液，加入500µL酸性提取液使之中和；混匀， 10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3. 细胞或细菌中NADP⁺和NADPH的提取：

NADP⁺的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（10⁴个）：酸性提取液体积（1mL）为500-1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL酸性提取液），超声波破碎（冰浴，强度20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次），95℃水浴5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴中冷却后，10000g，4℃离心10min，取500µL上清液，加入500µL碱性提取液 使之中和；混匀，10000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

NADH的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（10⁴个）：碱性提取液体积（1mL）为500-1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL碱性提取液），超声波破碎（冰浴，强度20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次），95℃水浴5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴中冷却后，10000g，4℃离心10min，取500µL上清液，加入500µL酸性提取液 使之中和；混匀，10000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤(在1.5mL EP管中按下表依次加样）：

混匀，取200µL转移至微量石英比色皿或96孔板中，570nm下读取对照管吸光值A1和测定管吸光值A2，计算∆A=A2-A1。

注意事项： 

1. 如果一次性测定样本数较多，可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。

2. 对照管和测定管的测定步骤的区别：对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六； 测定管加完试剂一、二、三、四和五后必须反应20min后再加试剂六。

3. 反应过程中注意避光。

4. 由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒100管保证测48个NAPD+或NAPDH。

NADP+和NAPDH含量的计算

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（一）NADP+含量的计算

1. 血清（浆）中NADP+含量计算

NADP⁺含量(nmol/mL）=[4.57×（∆A-0.062）×V1]÷(V3×V1÷V2) =91.4×（∆A-0.062）

2. 组织中NADP+含量计算

(1) 按样本蛋白浓度计算

NADP⁺ (nmol/mg prot）= [4.57×（∆A-0.062）×V1]÷(V1×Cpr) =4.57×（∆A-0.062）÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算

NADP⁺ (nmol/g 鲜重）=[4.57×（∆A-0.062）×V1]÷(W×V1÷V2) =9.14×（∆A-0.062）÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

NADP⁺ (nmol/10⁴cell）= [4.57×（∆A-0.062）×V1]÷(500×V1÷V2) =0.0183×（∆A-0.062）

(二) NADPH含量的计算 

1. 血清（浆）中NADH含量计算

NADPH 含量(nmol/mL）=[7.2×（∆A-0.072）×V1]÷(V3×V1÷V2) =144×（∆A-0.072）

2. 组织中NADPH含量计算

(1) 按样本蛋白浓度计算

NADPH(nmol/mg prot）= [7.2×（∆A-0.072）×V1]÷(V1×Cpr) =7.2×（∆A-0.072）÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算

NADPH (nmol/g 鲜重）=[7.2×（∆A-0.072）×V1]÷(W×V1÷V2) =14.4×（∆A-0.072）÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

NADPH(nmol/10⁴ cell）= [7.2×（∆A-0.072）×V1]÷(500×V1÷V2) =0.0288×（∆A-0.072）

V1：加入反应体系中样本体积，0.02mL；V2：加入提取液体积，2mL；V3：加入血清（浆）体积，0.1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

b. 用96孔板测定的计算公式如下 

（一）NADP+含量的计算 

1. 血清（浆）中NADP⁺含量计算

NADP⁺含量(nmol/mL）=[9.14×（∆A-0.062）×V1]÷(V3×V1÷V2) =182.8×（∆A-0.062）

2. 组织中NADP+含量计算

(1) 按样本蛋白浓度计算

NADP⁺ (nmol/mg prot）= [9.14×（∆A-0.062）×V1]÷(V1×Cpr)=9.14×（∆A-0.062）÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算

NADP⁺ (nmol/g 鲜重）=[9.14×（∆A-0.062）×V1]÷(W×V1÷V2) =18.28×（∆A-0.062）÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

NADP⁺ (nmol/10⁴cell）= [9.14×（∆A-0.062）×V1]÷(500×V1÷V2) =0.0366×（∆A-0.062）

（二）NADPH含量的计算 

1. 血清（浆）中NADH含量计算

NADPH含量(nmol/mL）=[14.4×（∆A-0.072）×V1]÷(V3×V1÷V2) =288×（∆A-0.072）

2. 组织中NADPH含量计算

(1) 按样本蛋白浓度计算

NADPH(nmol/mg prot）= [14.4×（∆A-0.072）×V1]÷(V1×Cpr) =14.4×（∆A-0.072）÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算

NADPH (nmol/g 鲜重）=[14.4×（∆A-0.072）×V1]÷(W×V1÷V2) =28.8×（∆A-0.072）÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

NADPH(nmol/10⁴ cell）= [14.4×（∆A-0.072）×V1]÷(500×V1÷V2) =0.0576×（∆A-0.072）

V1：加入反应体系中样本体积，0.02mL；V2：加入提取液体积，2mL；V3：加入血清（浆） 体积，0.1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

注意：Γ低检测限为1nmol/mL或1nmol/g鲜重或0.01nmol/mg prot。