SAINT-BIO/尚宝生物 BA1118 谷胱甘肽还原酶（GR）活性检测试剂盒（微量法）

谷胱甘肽还原酶（GR）活性测定试剂盒（微量法） 注意：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。 产品货号：BA1118 产品规格：100管/96样 产品简介： GR是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶，是谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶之一(通 常昆虫中GR被TrxR取代)。GR催化NADPH还原GSSG生成GSH，有助于维持体内GSH/GSSG比值。GR在氧化胁 迫反应中对活性氧清除起关键作用，此外GR还参与抗坏血酸-谷胱甘肽循环途径。 GR能催化NADPH还原GSSG再生GSH，同时不断消耗NADPH生成NADP +；NADPH在340nm有特征吸收峰， 相反NADP +在该波长无吸收峰；通过测定340nm吸光度下降速率；来测定NADPH脱氢速率，从而计算GR活性。 产品内容： 试剂一：液体120mL×1瓶，4℃保存。 试剂二：液体1mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：粉剂×1支，4℃保存。临用前加入2.0 mL蒸馏水，混匀。 需自备的仪器和用品： 低温离心机、水浴锅、移液器、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板（UV板）和蒸馏水。 操作步骤： 一、粗酶液提取 称约0.1g组织，加入1.0 mL试剂一，冰上充分研磨，10000rpm 4℃离心10min，取上清液，待测。 二、GR 测定操作： 1. 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到340nm，蒸馏水调零。 2. 试剂一置于25℃(普通物质)或者37℃(哺乳动物)中预热30min以上。 3. 空白管：取微量石英比色皿或96孔板，加入10μL试剂二，20μL试剂三，170μL试剂一，于340nm测定10s和190s 吸光度，记为A空1和A 2。 4. 测定管：取微量石英比色皿或96孔板，加入10μL试剂二，20μL试剂三，20μL上清液，150μL试剂一，于340nm 测定10s和190s吸光度，记为A测1和A测2。 注：样品测定10s时吸光度后，将比色皿放入25℃（普通物质）或者37℃（哺乳动物）水浴，3min后拿出，吸打 混匀，立即测定190s时的吸光度。 三：GPX活性计算： a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下 （1）按蛋白浓度计算 活性单位定义：在一定温度中，pH8.0条件下，每毫克蛋白每分钟催化1µmol NADPH氧化为一个酶活力单位。 GR酶活(U/mg prot)= [ (△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×10 6] ÷(Cpr×V样)÷T =0.536×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr （2）按样本质量计算 活性单位定义：在一定温度中， pH8.0条件下，每克样本每分钟催化1µmol NADPH氧化为一个酶活力单位。 GR酶活(U/g)= [ (△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×10 6] ÷(W×V样÷V样总)÷T =0.536×(△A测定管-△A空白管)÷W △A空白管=A空1-A空2 ，△A测定管=A测1-A测2 ；ε ：NADPH摩尔消光系数6.22×10 3L/mol/cm；d：比色 皿光径，1 cm；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10 -4 L；10 6：1mol=1×10 6μmol； Cpr：上清液蛋白浓度（mg/mL）； W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL =2×10 -2 mL；V样总：提取液体积，1mL；V样总：提 取液体积，1mL；T：反应时间，3min。 b. 使用96孔板测定的计算公式如下 （1）按蛋白浓度计算 活性单位定义：在一定温度中，pH8.0条件下，每毫克蛋白每分钟催化1μmol NADPH氧化。 GR酶活(U/mg prot)= [ (△A测定-△A空白)÷(ε×d)×V反总×10 6]÷（Cpr×V样）÷T =0.893×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr （2）按样本鲜重计算 活性单位定义：在一定温度中，pH8.0条件下，每克样品每分钟催化1μmol NADPH氧化。 GR酶活(U/g 鲜重)= [(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总×10 6]÷(V样÷V样总×W÷T =0.893×(△A测定管-△A空白管)÷W △A空白管=A空1-A空2 ，△A测定管=A测1-A测2 ； ε ：NADPH摩尔消光系数6.22×10 3L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.6cm；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10 -4L；10 6：1mol=1×10 6μmol；Cpr：上清液蛋白浓度（mg/mL）； W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL =2×10 -2 mL；V样总：提取液体积，1mL；V样总：提 取液体积，1mL；T：反应时间，3min。 注意事项： 1. 样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，匀浆液避免反复冻融。 2. 试剂三须现配现用，配置完后，置于冰上。 3. 测定前须先用1～2个样做预实验，确保180s内吸光值变化呈线性，哺乳动物组织一般须用试剂一稀释2～5 倍。 4. 细胞中GR活性测定时，细胞数目须在300万-500万之间，细胞中GR的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理， 不能用细胞裂解液处理细胞。