SAINT-BIO/尚宝生物 BA1123 谷氨酸脱氢酶（GDH）活性检测试剂盒（紫外分光光度法）

谷氨酸脱氢酶（GDH）活性检测试剂盒（紫外分光光度法）

注意：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

产品货号：BA1123

产品规格：50管/48样

产品简介：

GDH（EC 1.4.1.2）广泛分布于植物中，和谷氨酸合成酶（GOGAT）共同参与谷氨酸的合成，在氨同化和转化成有机氮化合物的代谢中起重要作用。

GDH催化NH4⁺、α-酮戊二酸和NADH，生成谷氨酸和NAD⁺，引起340nm吸光度下降。通过测定340nm吸光度的下降速率，计算GDH活性。

产品内容：

提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体60mL×瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、粗酶液提取：

1、收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3秒，间隔10秒，重复30次）；8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。

2、称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤：

1、紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

（1）工作液的配制：临用前将试剂一加入试剂二中混合溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴5min；

（2）取1mL工作液和0.05mL样本于光径为1cm的1mL石英比色皿中，混匀，加样本的同时开始计时，在340 nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1和5分20秒时的吸光度A2，计算ΔA=A1-A2。

注：当ΔA大于0.5时，将样本进行稀释后测量。

三、GDH活性计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GDH（U/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V样) ÷T=675×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GDH（U/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样÷V样总×W) ÷T=675×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞数量计算： 

单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GDH（U/10⁴ cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样÷V样总×500) ÷T=1.35×ΔA

V反总：反应体系总体积，1.05×10^-3L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

注意事项：

1、当∆A大于0.5时，将样本进行稀释后测量。

 2、由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约1mg/mL），所以在测定样品蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。