PYREX/康宁 克隆环

克隆环使用具体步骤：

材料

无菌材料：

1、 镊子

2、 巴氏吸管或200ul移液器及吸头（Sorenson 15720）

3、 1ml移液管

4、 6孔板或T25培养瓶

5、 60mm玻璃细菌培养皿，包括10个克隆环

6、 60mm玻璃细菌培养皿，包括无菌硅脂（可以用甘油或者凡士林灭菌后替代）

培养基及缓冲液：

1、 不含钙镁的磷酸缓冲液（CMF-PBS）（Bioind）

2、 0.25%胰酶

3、 适合挑选细胞的培养基

4、 适合挑克隆的含有20-40个克隆的培养皿

步骤：

1、 用倒置显微镜或解剖显微镜检查包含好分离克隆的培养皿，通过调整光照强度和角度，挑选可看到的活细胞克隆是完全可能的。

2、 一旦找到满意的克隆，用marker笔在培养皿底部相应位置画一个圈圈住该克隆。选择大小比较平均的克隆（太大的克隆不要选，来源可能是一簇细胞而不是单个），另外要选择比较好分离的克隆。

3、 移除丢弃培养液，用CMF-PBS冲洗板两次，并移除悬浮起来的细胞。

4、 用无菌镊子夹起一个克隆环，轻轻的将克隆环底部粘上无菌硅脂，然后快速垂直拿起。如果操作得当，无菌硅脂将均匀分布在克隆环底部。轻轻的将克隆环放在一个选定的克隆之上，并用镊子稍用力均匀按压，压力不均匀会导致克隆环底部不密封而漏液。操作过程要小心，不要滑动碰到或滑过细胞克隆，以免硅脂覆盖细胞，而导致胰酶无法接触细胞并消化细胞。

5、 在显微镜下确认克隆环位置在选定的克隆之上，保证在克隆环密闭的区域内没有其他克隆。

6、 加0.2ml胰酶（0.25%）到克隆环里。

7、 将培养皿在36.5℃孵育5分钟。每隔两三分钟在显微镜下观察一次细胞，知道细胞开始变圆并脱离培养皿底部。加一两滴培养液到克隆环中，并轻轻用巴氏吸管或移液器吸出细胞。

8、 将细胞转移至合适的培养器皿中并加适量的培养液。大一点的克隆可以选择用T-25的培养瓶或6孔板，对于小一点的克隆可以用12孔或者24孔板。细胞过于稀释可能会导致细胞生长缓慢或不生长，所以在Γ次转移之后用培养基反复冲洗克隆环以转移剩余的细胞是非常有必要的。

9、 培养细胞。

据文献报道，克隆环对于肿瘤细胞的克隆，或者分离具有不同生物学性质的肿瘤细胞株亚群也是简单而行之有效（具体文献见肿瘤防治研究）。